猪TLR3分子基因的克隆、表达及其PK-15稳定表达细胞系的建立
Cloning、Expression and Establishment of Stable Expression Transfected PK-15Cells Line of Procine TLR3Gene
天然免疫系统是机体抵抗病原入侵的第一道防线。当病原微生物感染宿主后，机体通过广泛表达的模式识别受体监测病原相关分子模式（pathogen associatedmolecular pattern, PAMP）的存在，而诱导产生Ⅰ型干扰素(type I interferon，IFN)和促炎性细胞因子等一系列的抗病毒免疫反应。Toll样受体（TLRs）是机体模式识别受体的重要家族之一，其中Toll样受体3(TLR3)作为病毒双链RNA的识别受体在机体抗病毒天然免疫中发挥着十分重要的作用。由于猪等家畜TLR3的结构与功能研究在国内外报道较少，因此本研究以合作小型猪为对象，克隆、表达分析猪TLR3分子的基因结构、遗传演化关系以及生物学功能特性，通过建立稳定表达含绿色荧光蛋白与TLR3的PK-15细胞系作为其结构与功能研究的细胞模型，为进一步的抗病毒分子机制研究奠定基础。现已取得以下几方面的研究结果：1、应用RT-PCR技术从猪外周血淋巴细胞中克隆了猪Toll样受体3（pTLR3）及其剪接体基因（pTLR3a、pTLR3b）。pTLR3基因序列分析表明，克隆基因的ORF为2718bp，编码905个氨基酸；推导的氨基酸序列分析表明，在其胞外区含有LRRs结构域，胞内区含有TIR结构域，具有TLR家族的典型结构特征。对剪接体分析显示，pTLR3a、pTLR3b基因分别完全或部分缺失第3外显子，是缺乏编码跨膜区和胞内区结构的分子。其中TLR3a基因属于TLR3整个外显子3的完全缺失，而TLR3b基因则是第3外显子3’末端部分序列的选择性缺失。pTLR3序列遗传演化分析显示，其与牛、马、猫和人的遗传演化关系较近，与家兔、鼠的次之，而与鸡的较远。2、本研究成功构建了pTLR3胞外区3个部分序列的基因片段的原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，在42℃以0.6mmol uL-1IPTG诱导下，高表达出了GST-pTLR3融合蛋白，且主要以包涵体形式存在。利用切胶、电洗脱法纯化融合蛋白，将其免疫家兔制备多克隆抗体，并作为一抗应用于Western-blot和间接免疫荧光试验，证明其可与转染了pTLR3的PK-15细胞发生免疫反应，表明制备的多克隆抗体具有特异性好、效价高的特点。3、本研究成功构建了pEGFP-N1-pTLR3和pcDNA3.1-His-pTLR3真核表达载体，将其转染PK-15细胞后，利用G418抗性筛选，结合有限稀释法筛选到了一株稳定表达pTLR3与EGFP融合蛋白的单克隆细胞系。用RT-PCR和Western-blot分析方法在mRNA和蛋白水平对阳性细胞进行检测，发现pTLR3-EGFP融合蛋白在PK-15细胞系中得到了稳定表达，这为进一步研究pTLR3的生物学功能奠定了基础。
- 作者：
- 管齐赛
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 杨孝朴；景志忠
- 中图分类号：
- S828
- 关键词：
- 猪TLR3；剪切体；克隆表达；多克隆抗体；细胞系
- pTLR3；splicing isoforms；clone；expression；polyclonal antibody；cells line