副猪嗜血杆菌冻干保护剂及ompA蛋白表达、纯化及免疫原性的研究
副猪嗜血杆菌(HaemopHilus parasuis,HPS)是引起猪Glasser氏病的病原体,在临床上以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征.随着世界养猪业的发展,该病以成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病.
利用基因敲除策略构建HPS弱毒疫苗是当前HPS研究的热点.但HPS对外界抵抗力不强,4℃仅可存活7~10日,在冻干过程易死亡,菌体死亡后免疫猪体产生过敏反应,影响弱毒疫苗的应用.为提高HPS存活率,本研究研制了HPS冻干保护剂,为HPS弱毒疫苗研发提供技术储备.
HPS外膜蛋白ompA的单克隆抗体在体内(小鼠)和体外都表现出中和保护活性,证明ompA可作为亚单位疫苗,因而表达ompA并研究其免疫原性.本研究从两个方向展开:
1.副猪嗜血杆菌冻干保护剂研制
为冻干HPS,首先筛选出BHI为适宜HPS生长的培养基,并冻干副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株鸡胚卵黄菌液,作为工作种子批.
为筛选HPS冻干保护剂配方,采用冻存实验筛选高存活率配方,测定配方共晶点,设计冻干曲线,测定其冻干存活率为20~30%.利用单组分缺失实验分析各组分的重要性并调整组分比例.为提高保护剂存活率,研究了保护剂基质如海藻糖、氨基酸、PH值、缓冲系统和BHI培养基等对HPS冻干存活率的影响,结果证明:保护剂中添加1%海藻糖,冻干存活率提高至56.68%;添加3%L-精氨酸盐酸盐存活率提高至65%~70%;保护剂与BHI培养基按照2∶1配比,副猪嗜血杆菌冻干存活率可达73.69%~80%.
为确定影响存活率的显著因子及其最佳水平,采用Plackett-Burman实验和Box-Behnken响应面实验优化保护剂配方,结果证明D-海藻糖、D-山梨醇和L-精氨酸盐酸盐为影响存活率的显著因素.
2.副猪嗜血杆菌外膜蛋白ompA克隆表达
设计引物扩增副猪嗜血杆菌外膜蛋白ompA基因,连接原核表达载体pET-32a,成功构建了ompA基因原核表达载体pET-32a-ompA.并在BL21大肠杆菌原核表达系统中以包涵体形式表达.Westernblot显示表达蛋白与副猪嗜血杆菌HS80阳性血清发生特异性反应.优化表达ompA蛋白条件.将ompA蛋白与佐剂50v乳化,三个实验组豚鼠分别免疫100μ g/只、200μ g/只、300μg/只不同剂量蛋白,初次免疫两周后进行二免,二次免疫两周后用最小致死量HS80菌株攻毒.结果显示ompA免疫攻毒存活率为40%.
- 作者：
- 杨晓菲
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2013年
- 导师姓名：
- 王栋
- 中图分类号：
- S858.28
- 关键词：
- 副猪嗜血杆菌；冻干保护剂；ompA蛋白；免疫原性
- HaemopHilus parasuis； Cryoprotectant； ompA