利用昆虫杆状病毒表达系统表达大鼠HongrES1基因
Expressing rat gene HongrES1 with insect baculovirus expression system
HongrES1是在大鼠cDNA文库中筛选Monkey ESC615同源物时发现的一个新的基因,该基因全长1590bp,并推定其编码415个氨基酸残基,序列分析表明它可能是serpin(serine protease inhibitor)家族的新成员,原位杂交显示该基因特异表达于附睾尾部靠近输精管的区域,可能在精子的成熟过程中具有重要作用. 昆虫杆状病毒表达系统产生于20世纪80年代初期.目前,已有越来越多的蛋白从该系统中得到表达,它已被公认为当今基因工程四大表达系统之一.昆虫杆状病毒表达系统有操作简单,表达量高等优点,而且属于真核表达系统,这对于表达真核生物的蛋白质尤其有用. 实验第一部分为在大肠杆菌中对HongrES1进行表达.将HongrES1基因克隆至pcDNA3.1质粒中,通过IPTG进行诱导,分别间隔1h后取样,将样品进行SDS-PAGE及Western blot分析,发现HongrES1在大肠杆菌中能得到表达,但其表达量较低,并且表达出的蛋白随着时间的延长而发生降解. 实验第二部分为利用昆虫杆状病毒表达系统在High five细胞中表达HongrES1基因.将HongrES1基因分别克隆至pFastBacHT-B质粒及核角体启动子经删减后的pFastBacHT-B质粒中,转化到DH10BAC菌株中,抽提Bacmid并在Sf9细胞中制备病毒,并对其滴度进行测定.分别以MOI为0.5,1,5,10 PFU/cell感染24h,48h,72h后比较其蛋白表达量,发现当MOI为0.5、1 PFU/cell感染72h、48h时所得样品的OD450值与MOI为5 PFU/cell感染48h 的OD450值较高且无显著差异.并利用定量PCR对完整启动子与缺失型启动子对HongrES1表达量的影响进行了分析,结果发现完整型启动子的表达量仅为缺失型的1.8倍,并无太大影响.将制备的重组病毒感染High five细胞后,HongrES1被分泌至培养液上清中,对培养液上清进行SDS-PAGE及Western blot分析,表明HongrES1在High five细胞中能够得到表达,但表达量仍然维持在较低水平. 实验第三部分为利用昆虫杆状病毒表达系统在家蚕中表达了大鼠HongrES1基因,并对其表达时间进行了优化,进行大量表达后,利用镍离子亲合层析柱进行了初步纯化.发现用滴度为2.75*108PFU/ml的重组病毒以每头家蚕10μl的注射量进行为期4天的表达时,能得到较多的重组蛋白,成熟的蛋白被分泌到家蚕的血淋巴中.将收集到的家蚕血清进行相关的处理后,上样至镍离子柱,用250mM的咪唑洗脱,通过SDS-PAGE及Western blot分析,纯化达到了一定的目的.??
- 作者：
- 张四才
- 学位授予单位：
- 云南农业大学
- 专业名称：
- 农业昆虫与害虫防治
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2006年
- 导师姓名：
- 肖春
- 关键词：
- HongrES1基因；杆状病毒；家蚕；蛋白纯化
- HongrES1；baculovirus；silkworm；protein purification