猪肌肉生长抑制素(Myostatin)基因敲除的研究
Myostatin gene knockout in pig
肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN) 是一类对骨骼肌生长具有负调控作用的因子.研究者对小鼠、牛、狗等物种的研究表明,MSTN 基因的缺失或突变会引起其骨骼肌重量的显著增加.因此,本研究旨在利用核移植和基因打靶技术制备MSTN 基因敲除猪,从而大幅提升猪胴体瘦肉率,达到提高饲料利用率、降低饲养成本的目的. 本研究首先利用Red 同源重组系统介导的"gap–repair"基因抓捕技术,从含大白猪MSTN 基因座的BAC(细菌人工染色体) 上亚克隆9.9 kb 的打靶同源长臂(LA).以大白猪MSTN BAC 为模板,采用PCR 的方法扩增1.5kb 的打靶同源短臂(SA),经序列测定,同源性为100%,将获得的完全同源的SA 和LA 依次连接到打靶骨架载体pLOXP 上,构建大小为17.9kb 的正负筛选打靶载体pLOXP–MSTN–KO.该载 体的功能元件依次为打靶同源长臂(LA)、LoxP 位点、PGK 启动子、neo 正筛选基因、ployA、LoxP 位点、打靶同源短臂(SA),HSV–tk 负筛选基因. 将构建完成的打靶载体经 Not I 线性化后,通过电击转染胎儿成纤维细胞系09LW3 和09LW6,用含有600μg/mL 的G418 和2μM 的GANC 的正负筛选培养液进行约7 ~10 天的筛选,共获得克隆点1190 个,经过PCR 鉴定共获得7 个MSTN+/? 细胞克隆点. 以其中2 个生长状态较好的MSTN+/? 细胞克隆做为供体细胞进行核移植,重构胚经融合激活后进行体外培养,其体外发育能力与普通重构胚无显著差异(P>0.05).选取形态较好的重构胚移植到9 头受体母猪中.37 天B 超检测其中5头受体怀孕,将其中1 头处死,共获得5 个胎儿,经PCR 鉴定有1 头为MSTN 基因定点敲除克隆胎儿,其余为随机整合转基因胎儿.剩余4 头受体母猪仍处于妊娠中. 综上所述,本研究成功构建基因打靶载体,并获得7 个MSTN+/? 细胞克隆点,通过核移植以及胚胎移植,已经获得了1 头MSTN 基因单敲除克隆猪胎儿.为MSTN 基因敲除猪的制备奠定了基础,并为猪的新品种培育提供了材料.??
- 作者：
- 李鸿辉
- 学位授予单位：
- 云南农业大学
- 专业名称：
- 动物遗传育种与繁殖
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2007年
- 导师姓名：
- 哈福
- 关键词：
- 猪；Gap–repair；基因打靶；正负筛选；Myostatin
- Pig；Gap–repair；Gene targeting；Positive–negative–selection；Myostatin