凤仙花坏死斑病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系构建
Establishment of Real-Time Fluorescent Quantitative PCR Assay for Detection of Impatiens necrotic spot virus
凤仙花坏死斑病毒(Impaliens Necrotic Spot Virus, INSV)属于番茄斑萎病毒属(Tospovirus)布尼亚病毒科(Bunyaviridae),一般分布在热带、亚热带和温带地区,并能对许多作物和花卉造成严重的危害.目前,电镜学、血清学和分子生物学这三种检测方法已广泛地运用于对INSV 病毒的定性检测.本研究根据INSV上保守的NSs核酸序列,应用DNAstar、DNAman、Primer 3.0和Primer 5.0等四种生物信息软件,完成引物和相应的探针的设计,成功构建了INSV病毒的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测体系,并对该检测体系的特异性、重复性和灵敏度进行了评价以及分别在三种植物上得到了初步应用.结果显示:本检测体系能有效地把INSV从同属的TSWV、TZSV和CCSV这三种病毒中区分出来,测检率明显高出免疫试纸条检测.该检测方法,不仅能定性检测INSV病毒,而且能精确检测出病毒含量,其最低能检测出INSV病毒6.99拷贝/μl.在此方法的初步应用中Ct值差异在0~1.5,说明所构建的TaqMan荧光定量RT-PCR具有良好的稳定性、重复性和再现性.构建标准曲线斜率为:-3.315,相关系数:0.997,标准曲线制作良好,具有很好的实用性.该方法的成功构建对进一步研究INSV和其传毒特性的研究打下了很好的基础.??
- 作者：
- 徐小刚
- 学位授予单位：
- 云南农业大学
- 专业名称：
- 生物化学与分子生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 刘雅婷
- 关键词：
- 番茄斑萎病毒属；TaqMan探针；实时荧光定量RT-PCR；绝对定量
- Tospovirus；TaqMan probe；Real-time fluorescence quantitative RT-PCR；Absolute quantification