重组腺病毒的生产工艺研究
Study on purification of the recombinant Adenovirus
腺病毒载体(Adenovirus Vector,ADV)作为基因治疗的运载系统具有感染率高、可稳定整合表达、宿主范围广泛、对宿主毒性小等优点,各种重组腺病毒基因药物在抗肿瘤、心血管疾病治疗、遗传疾病治疗等方面的研究越来越受到人们的重视,用于临床前和临床研究的药用级腺病毒产品需求也日趋增加,因此需要建立高效且成本低廉,安全、可控、操作实施方便,能够大规模放大生产的工艺.持续灌注悬浮培养HEK293细胞是目前生产腺病毒最常用的方法之一,通过不断更换培基,优化了细胞培养环境,从而可达到较高的细胞密度.氯化铯密度梯度超速离心法虽然是生产临床级重组腺病毒产品的有效方法,但是此法不能放大,不适合工业化生产.近年来应用超滤、阴离子交换树脂和分子筛层析结合的方法已经逐渐成为了主要分离纯化手段并取得了较好的结果. 本文对灌注培养HEK293细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)、携带肝细胞生长因子基因的腺病毒载体(Ad-HGF)进行了实验研究.结果表明,灌注率为1.5~2vol/d比较合适;感染腺病毒后48小时是收获细胞的最佳时机,细胞密度在3.0*106/ml左右感染病毒时单细胞病毒和单位体积病毒产量均较高.通过上述实验我们初步建立起了利用5L生物反应器悬浮培养293 N3S细胞生产重组腺病毒的生产工艺,可以获得较大量高滴度的重组腺病毒. 我们应用Source 15Q阴离子交换色谱和Sepharose 4 Fast Flow分子筛层析法对含有重组腺病毒Ad-GFP和AD-HGF的细胞裂解液进行分离纯化.实验结果显示,经超滤可以去除大部分小分子杂质,Source 15Q阴离子交换色谱分离纯化可以有效去除细胞裂解液中的核酸、杂蛋白和内毒素,Sepharose 4 Fast Flow分子筛层析进一步去除杂蛋白.最终的腺病毒回收率在50%左右.产品经A260/A280比值,HPLC检测分析,纯度可达95%以上.此方法省时省力,可以进行灵活放大,适合于商业化生产.??
- 作者:
- 王晓娜
- 学位授予单位:
- 云南农业大学
- 专业名称:
- 预防兽医学
- 授予学位:
- 硕士
- 学位年度:
- 2009年
- 导师姓名:
- 张以芳
- 关键词:
- 重组腺病毒;生产工艺;质量检测;纯化
- recombinant Adenovirus;production process;quality detection;purification