天然活性物质诱导人和鼠成纤维细胞分化为多能干细胞的研究
Study on Differentiated Human and Mouse Fibroblast Cells into Multipotent stem Cells by Natural Active Compound
目的:多能性干细胞是治疗动物机体各种组织损伤、遗传病和退行性疾病等的理想材料,但来源困难.成体细胞逆向分化为多能性干细胞的实验方法开辟了多能干细胞来源的新途径,但存在诱导效率低,技术操作难度大,设备要求高,成本高,且由病毒载体介入等诸多问题.本实验利用水生动物卵母细胞提取物诱导成体细胞分化为多能性干细胞,建立了多能性干细胞诱导的新方法,避免了基因转染带来的安全隐患,提高了诱导效率,降低了成本和实验操作难度. 方法:①成纤维细胞的分离、培养:来源于SD大鼠和人皮肤组织的成纤维细胞,经酒精、双抗浸泡后,贴壁培养;②成纤维细胞的诱导:当细胞密度达到诱导所需数量时,开始添加诱导剂(淡水鱼生殖细胞提取物),设置不同的诱导浓度梯度和时间梯度;③细胞形态学观察:倒置显微镜观察细胞生长特性及形态特征;④免疫组织化学鉴定干细胞标志基因Oct4、 Sox2、c-Myc和Nanog的表达水平;⑤半定量PCR和实时定量PCR用于对干细胞标志基因Oct3/4、Sox-2、c-Myc和Nanog的表达水平进行定量;⑥畸胎瘤的接种:将诱导后的成纤维细胞,接种于裸鼠皮下,观察诱导细胞在体内的分化能力;⑦DNA甲基化修饰:采用亚硫酸氢盐修饰的方法测定基因Oct3/4、Sox-2和Nanog启动子区域的甲基化程度,从分子水平确定基因表达调控情况. 结果:①诱导后细胞生物学鉴定:倒置相差显微镜下观察随着诱导剂浓度的增加和诱导时间不断延长,细胞的形态在不断发生变化,由原来的梭形变得越来越不规则、体型也越来越大;②免疫组织化学分析结果显示基因Oct3/4、Sox-2、c-Myc和Nanog在诱导细胞内均为阳性表达;③畸胎瘤组织切片观察结果显示有血管、神经、肌肉和脂肪等组织生成.④半定量PCR和实时荧光定量PCR测定分析发现标志基因Oct3/4和Nanog均为诱导72小时时表达量最强.⑤DNA甲基化修饰测定发现基因Oct3/4和Nanog四个启动子区域的DNA甲基化程度比对照组低. 结论:1 水生动物卵细胞浆提取物联合细胞生长因子能够诱导成体细胞分化为多能性干细胞;2 诱导后,细胞形态学特征表现为由原来的梭形变为不规则形状,体形变的越来越大;3 诱导细胞内干细胞标志基因Oct3/4、c-Myc、Sox2和Nanog均为阳性表达,诱导剂量相同时,均以诱导72h时相对表达量最高,诱导时间相同时,均以时相对表达量最高.4 诱导细胞在体内能够分化为多种组织,如血管、神经、肌肉和脂肪等组织;5 诱导细胞内干细胞标志基因Oct3/4和Nanog启动子区域甲基化程度低,基因表达活跃.??
- 作者：
- 朱向情
- 学位授予单位：
- 云南农业大学
- 专业名称：
- 动物营养与饲料科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2009年
- 导师姓名：
- 潘兴华
- 关键词：
- 天然活性物质；成纤维细胞；多能干细胞；逆向分化
- natural active compound；fibroblast；pluripotent stem cells；reverse differentiation