东南亚蝰蛇毒凝血X因子激活剂(C1D1S1)的纯化及部分凝血特性研究
Purification and Partial properties of Blood Coagulation Factor X Activator (C1D1S1) from the Venom of the Southeast Asia Vipera
蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体,其主要活性成分为蛋白质.在这些蛋白质中存在多种具有促凝血的成分,可分别对不同的凝血因子进行激活.X因子(FX)在血液凝固中充当重要的角色,可被血液凝固的内外路径激活,是血液凝固的共同径路,因此FX激活剂具有很大的潜在开发利用的价值.本研究选择亚洲资源丰富的东南亚蝰蛇毒进行X因子激活剂的分离纯化和部分促凝血活性的研究,以探讨其开发利用的可能性. 本研究采用CM-Sepharose F.F阳离子交换柱、DEAE Sepharose F.F阴离子交换柱和Sphacryl 100凝胶层析柱分离纯化得到具有激活FX的组分(命名为C1D1S1).通过特异的发色底物法进行活性鉴定并利用SDS-PAGE进行分子量和纯度的测定.通过兔抗凝血浆的复钙凝固时间来测定Ca2+、pH值、温度、蛋白酶抑制剂对C1D1S1促凝活性的影响,及C1D1S1与血浆凝固时间的量效关系. 东南亚蝰蛇毒纯化所得的C1D1S1能特异的活化牛FX,使FXa的底物S-2765的酰胺键水解而发色.在非还原剂条件下,C1D1S1在SDS-PAGE胶上呈现单一蛋白带,分子量为82.26士1.07kDa(n=5);在还原剂条件下,SDS-PAGE呈现三条带,分子量分别为:64.11士1.91kDa(n=5),20.00士0.27kDa(n=5)和17.37士0.18kDa(n =5).C1D1S1能明显缩短家兔血浆复钙化时间,37秒内即可促使血浆凝固,空白对照的血浆复钙化时间为1分30秒,且促凝血活性表现一定的量效关系.C1D1S1对Ca2+的最适浓度为4mM-5mM/L;在pH7.4-7.79的Tris-Cl缓冲液中活性最高;在温度对C1D1S1促凝血活性影响上,在30℃以下基本保持稳定,相对活性保持在80%以上;在30℃-45℃范围内促凝活性强,相对活性保持在90%以上;80℃以上相对活性基本消失,仅剩1.3%.C1D1S1的凝血活性被金属蛋白酶抑制剂EDTA-Na2完全抑制,可被二硫键还原剂二硫苏糖醇(DTT)部分抑制. 通过研究可得出,东南亚蝰蛇毒经阳、阴离子柱和凝胶柱层析得到的FX激活剂属于Ca2+依赖性金属蛋白酶;该激活剂可在含有5mM/L 的CaCl2 pH7.5Tris- Cl缓冲液37℃条件下表现较强的促凝血活性.??
- 作者：
- 殷方臣
- 学位授予单位：
- 云南农业大学
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2009年
- 导师姓名：
- 范泉水
- 关键词：
- 东南亚蝰蛇蛇毒；血液凝固；Ca2+；因子X激活剂
- the Southeast Asia Vipera Venom；Blood Coagulation；Ca2+；Factor X Activator