新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的设计、合成及活性研究

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂为目前靶向抗肿瘤药物研究热点,已有两个药物上市,多个药物处于临床研究阶段.其中,苯甲酰胺类HDAC抑制剂主要抑制肿瘤相关亚型酶HDACl,对肿瘤组织选择性高、药代特性好、毒副作用低、且可与靶向药物联合应用,为目前该领域的研究热点. 本论文以组蛋白去乙酰化酶抑制剂为主要研究方向,着重进行全新结构苯甲酰胺类HDAC抑制剂化合物的设计、合成及体外抗肿瘤活性筛选.通过体外筛选,选择优选化合物进行成药性比较研究,最终确定新型苯甲酰胺类HDAC抑制剂SIPI6861作为抗肿瘤候选新药结构,与国外同类型药物相比其具有深入开发价值和竞争优势. 同时,采用计算机辅助药物设计方法分析异羟肟酸类上市药物SAHA与组蛋白去乙醜化酶同源蛋白HDLP的结合模式,并结合SAHA的结构特点,设计合成一类全新母核骨架化合物,为异羟肟酸类HDAC抑制剂的进一步研究奠定基础.分述如下: 1、新型HDAC抑制剂先导化合物的设计 本论文基于对HDAC抑制剂上市药物及临床在研药物药效团分析,主要采用骨架迁越、生物电子等排等手段进行分子骨架的构建,共设计八个系列(A~H)全新结构目标化合物. 1)参考临床在研药物CI-994结构,结合前期研究经验,对其表面识别区和锌离子结合区进行修饰和优化,设计A类目标化合物17个. 2)以活性化合物SIPI6036母核为先导结构,通过链接区修饰、表面识别区骨架迁越等手段,设计B、C、D三类目标化合物.其中B类化合物13个、C类目标化合物23个、D类目标化合物14个. 3)基于对临床在研药物MS-275、西达本胺及MGCD0103的药效团分析,采用二次生物电子等排及骨架迁越的方法获得含4-氨基喹唑啉结构的先导化合物结构.对其进一步修饰及优化,设计E、F、G三类化合物.其中E类目标化合物10个、F类目标化合物34个、G类目标化合物8个. 4)采用计算机辅助药物设计方法对上市药物SAHA与HDAC同源蛋白HDLP的结合模式进行分析,并参考SAHA的结构特点,采用酰胺键互换、骨架迁越对SAHA母核进行改造,设计H类异羟肟酸类目标化合物12个. 2、新化合物及阳性对照药的合成与化学研究 对A~H系列目标化合物进行逆合成分析,设计出收率稳定,操作简便,且较为经济的合成路线,共合成目标化合物134个,133个为新化合物,化合物结构均经1HNMR、MS分析确证.进行C类目标化合物合成中,对HBTU作为缩合剂在水相中合成酰胺反应溶剂的选择及碱用量进行初步探索,研究结果可为此类缩合试剂在水相中使用提供参考. 对3个阳性药西达本胺、MGCD0103和SAHA的合成方法进行了初步研究和改进,以稳定的收率及较高的纯度得到产品,不仅为体内、外药理实验提供了高纯度的阳性对照药,亦为西达本胺、MGCD0103和SAHA作为品种开发奠定了基础. 3、新化合物体外抗肿瘤活性研究 完成8个系列共134个目标化合物体外HDAC1或HDACs酶抑制试验,探讨其初步构效关系,选择活性化合物进行体外抗肿瘤细胞增殖实验.结果表明: 1)A类化合物对HDAC1酶抑制活性不显著,但其抗肿瘤细胞增殖活性较好,其中化合物SIPI6905体外抑酶活性与阳性对照药CI-994相当,对多株肿瘤细胞增殖活性优于CI-994,且对人正常胚肺细胞无抑制作用,具有进一步研究价值. 2)B类化合物对HDAC1抑酶活性弱于阳性对照药MS-275,推测哌嗪环的引入可能并非影响活性的主要因素,此为B类化合物的后续设计提供了参考. 3)C类化合物具有较好的体外HDAC1酶抑制活性和抗肿瘤细胞增殖活性. SIPI6904、SIPI6908、SIPI6909、SIPI6912、SIPI6914、SIPI6917和SIPI6925七个化合物抑酶活性优于或相当于阳性药MS-275.其中化合物SIPI6908显示较好的体外肿瘤细胞抗增殖活性,对PC-3前列腺癌细胞、JurkatE6-1急性T细胞、Hut78人T淋巴细胞、 A549肺癌细胞及HCT116人结直肠癌细胞抑制活性均优于阳性对照药MS-275,对MRC5人胚胎细胞无毒性,具有进一步研究价值. 4)D类化合物体外HDAC1酶抑制活性弱于阳性对照药,推测苯并咪唑的咪唑环上N原子的引入可能并不能与氨基酸残基形成氢键相互作用. 5)E类化合物体外HDAC1酶抑制实验结果表明:4-氨基喹唑啉2位引入取代基不利于化合物的抑酶活性,此为后续F类化合物的设计提供了参考. 6)F类化合物中部分化合物如SIPI6861、SIPI6862、SIPI6865和SIPI6868抑酶活性优于或相当于阳性对照药MS-275.其中化合物SIPI6861显示较好的体外肿瘤细胞抗增殖活性,对JurkatE6-1急性T细胞、Hut78人T淋巴细胞、A549肺癌细胞具有较好的抑制活性,优于或相当于阳性对照药MS-275,且对人正常细胞无毒性. 7)G类化合物HDAC1抑酶活性与阳性药相比,未见提高,分析原因可能与B类化合物相似,即哌嗪环并非影响活性的关键因素. 8)H类化合物显示较好的体外HDACs酶抑制活性,部分化合物抑酶活性优于阳性药SAHA,抗肿瘤增殖活性与SAHA相当,分子对接结果验证了H类化合物设计思想的合理性.研究结果为下一步设计合成活性更高的异羟肟酸类HDAC抑制剂提供了参考. 4、优选化合物成药性比较研究 根据体外活性结果,选择A类化合物中的SIPI6905、C类化合物中的SIPI6908、F类化合物中的SIPI6861以及本课题组前期发现的活性化合物SIPI6036共四个化合物作为优选化合物进行急性毒性实验、初步药代实验、hERG钾通道影响实验及裸鼠体内抑瘤实验等成药性比较研究. 研究结果表明:化合物SIPI6861具有较好的成药性特征,其对HDAC1酶及多株肿瘤细胞株抑制活性优于阳性药MS-275,急性毒性低、药代特征良好、潜在心脏毒性小,人源移植瘤裸鼠体内实验同等剂量下药效与MS-275相当但毒副作用小,具有作为新型靶向抗肿瘤候选药物深入开发价值. 综上所述,通过本论文的研究工作,经过多个梯次化合物设计→合成→活性比较→再设计→再比较…,及时淘汰成药性依据不够充分的化合物,最终确定具有较好成药特征的化合物SIPI6861作为HDAC抑制剂靶向抗肿瘤候选新药,论文研究结果达到了预期目标;本论文所设计的多个系列全新结构目标化合物丰富了现有HDAC1抑制剂的结构类型;化合物体外抑酶初步构效关系结果不仅可为HDAC1酶的生物学研究提供参考,亦为后续获得活性更高、安全性更好的梯队化合物奠定了基础;鉴于国内对于此靶点抗肿瘤药物的研究尚处于起步阶段,本论文所获经验,可为进行该靶点1.1类创新药物研究及本课题自身的深化,提供理论及实践的有益参考. 本论文研究内容获得国家十一五"重大新药创制"专项资助,项目编号: 2009ZX09103-049,目前已顺利结题;化合物SIPI6861具有抗肿瘤候选新药研究价值,目前正进行临床前系统研究工作. 关键词 组蛋白去乙酰化酶抑制剂,抗肿瘤活性,计算机辅助药物设计,新化合物合成,A~H类化合物,构效关系