转Bt基因玉米安全性评价与致敏性的方法学研究

目的:选择种植面积广并已商业化的转crylAb基因玉米为对象,针对Bt杀虫蛋白进行急性毒性、亚慢性毒性(90天喂养试验)、致突变性和生殖毒性和潜在致敏性及免疫细胞毒性评价,研究转Bt基因抗虫作物的食用安全性. 方法:利用构建有crylAb基因的大肠杆菌JM103制备大量Bt蛋白,并从苏云金芽孢杆菌中提取较高纯度Bt蛋白用以制备Crylab蛋白抗体,通过SDS-PAGE分析和Western Blotting实验,鉴定和纯化表达系统制备的目的蛋白.同时,对目的蛋白进行小鼠急性毒性实验、大鼠90天喂养实验、致突变实验、生殖实验以及致敏性和免疫细胞毒性研究.本研究主要分三部分,即CrylAb蛋白制备与鉴定和食用安全性评价以及致敏性研究.(1) CrylAb蛋白制备与鉴定.①制备:利用构建有crylAb基因的大肠杆菌JM103,在LB培养基中扩增,获得晶孢混合物,在碱性条件下裂解,离心,取上清液溶于酸性条件下沉淀,洗涤沉淀物,进行SDS-PAGE电泳分析,纯化表达蛋白.②鉴定:从苏云金芽孢杆菌中提取Bt蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗体血清,并测定抗体效价.采用Western blotting方法鉴定表达蛋白.(2)食用安全性评价.①Bt蛋白急性毒性研究:采用40只ICR小鼠,雌雄各半,单次经口灌胃给予Bt蛋白,连续观察14天,计算MTD,研究Bt蛋白对小鼠的急性毒性作用.②亚慢性毒性试验(90天喂养试验):60只SD大鼠,雌雄各半,随机分为对照组、BSA组和Bt蛋白组,经口灌胃连续90天给予100㎎/㎏受试物.每天观察动物死亡情况和临床征状,记录每周体重和摄食量.于实验前和第91天采血进行AST、 ALT、ALP、BUN、CRE、GLU、T-Bil、TCHO、TP、ALB、Na、K、Cl等临床生化检查以及WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、PLT等血液学检查,同时进行大体解剖检查,对心、脑、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸和附睾(或子宫和卵巢)等主要脏器称重.③组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验(Ames):利用常规检测应用的基本组合菌株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535,采用标准平皿掺入法,在有或无代谢活化系统S9条件下平行检测,受试物以0.1㎎/皿作为最高浓度,共4个浓度,分别为12.5、25.0、50.0和100.0μg/皿和相应阳性对照.计数每个浓度回复突变菌落数.④染色体畸变实验:选用中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)进行染色体畸变分析,在有或S9条件下平行实验,每个平行实验均设阴性对照、低剂量25.0μg/mL、中剂量50.0μg/mL和高剂量100.0μg/mL及相应的阳性对照,观察200个中期分裂相细胞,计算染色体结构畸变率.⑤小鼠淋巴瘤细胞致突变实验(MLA):采用96孔板微孔法进行,将小鼠淋巴瘤L5178Y3.7.2c-tk〓细胞,在添加S9和不添加S9的情况下,经Bt蛋白1.25、2.50、5.00和10.00μg/mL不同浓度处理4小时,每个浓度组平行设2份,处理后在5%CO?、37℃加湿条件下继续培养48小时(表达时间),在含有三氟胸苷(TFT)的96孔板中接种一定数量的细胞.培养14天后,测定平板效率,计数含有细胞集落的孔数,计算基因突变率和相对存活率以及细胞相对总增长率.⑥体内微核实验:ICR性成熟小鼠60只,随机分成6组,分别为对照组、Bt蛋白低剂量37.5㎎/㎏、中剂量75.0㎎/㎏、高剂量150.0㎎/㎏ 24小时和48小时组以及阳性环磷酰胺对照组.采用口服灌胃途径,单次给予受试物,观察动物出现的毒性征状及死亡情况,并于给予受试物24小时和48小时(仅高剂量组)采样.每只动物计数200个正染红细胞(NCE)以确定嗜多染红细胞(PCE)的比例,同时计数至少2000个PCE中含微核的嗜多染红细胞,计算MPCE%.⑦早期生育力和胚胎发育毒性实验:性成熟SPF级Sprague-Dawley大鼠,共80只,雌雄各半,随机分为对照组和Bt蛋白组.雄性大鼠从交配前4周至2周交配期结束,每天1次经口灌胃给予受试物100㎎/㎏ Bt蛋白;雌性动物从交配前2周至怀孕第7天给予相同浓度受试物.每天观察动物各种毒性征状.动物交配前和交配期每周称重2次,孕期(GD0-15)每3天称重1次.每周测定一次摄食量(交配期除外).计算交配成功所需时间、交配率和授(受)孕率.所有动物进行大体解剖检查,雄性动物称重睾丸、附睾和前列腺,进行常规组织病理学检查;对雌性动物进行剖宫检查,观察有无胎盘异常(包括大小、颜色和形状),并记录黄体数、着床数、活胎、死胎和吸收胎数的位置和数目.⑧胚胎-胎仔发育毒性和致畸性实验:将交配成功的雌性大鼠50只,随机分为两组,对照组和Bt蛋白组.在怀孕第6~15天经口灌胃连续10天给予100㎎/㎏ Bt蛋白,每日1次.每天观察动物各种毒性征状并记录怀孕第0~20天的体重和每周摄食量.孕鼠于怀孕第20天进行解剖检查,记录黄体数、着床数、早期吸收胎数、晚期吸收胎数、死胎数和活胎数,以及子宫重和胎盘总重.对胎仔进行外观、内脏和骨骼检查,记录外观、骨骼、内脏的畸形和变异类型.(3)致敏性研究. ①致敏性方法学研究:采用经口灌胃和腹腔注射两种致敏途经,研究Balb/c小鼠、豚鼠和BN大鼠三种模型动物对OVA、BSA的致敏反应.口服致敏模型实验将36只动物随机分为3组(每组雌雄各半):阴性对照组、OVA组、BSA组.OVA组和BSA组动物分别给予5.0㎎/只和10.0㎎/只受试物.对照组给予同样容量的去离子水.腹腔注射致敏模型实验采用同样方法,对照组给予生理盐水.经口灌胃途经每日一次,持续6周;腹腔注射途径于第一天给予受试物,第7天重复一次.动物每周称重1次.实验期间每天观察动物的临床征状和死亡情况.两种致敏途经的模型动物分别于第0、7、14、21、28、35和42天取血,离心分离血清.另取未经受试物处理的健康动物,通过PCA实验测定特异性IgE抗体滴度;将采集的每只动物的抗血清进行一系列倍比稀释,采用ELISA方法,测定特异性IgE抗体水平.动物在第42天麻醉采血处死,观察并记录脾脏重量,同时进行常规组织病理学检查(HE染色).②ASA实验:选择合格的18只豚鼠,雌性,随机分为3组,每组6只,即生理盐水阴性对照组、10.0㎎/㎏ Bt蛋白组、OVA阳性对照组(5.0㎎/只),均为腹腔注射,隔日一次共5次进行致敏,末次致敏后14天经静脉注射受试物的2倍量进行激发.致敏期间每天观察动物的征状,致敏最初、最后一次和激发当日测定每组每只动物的体重.激发后即刻起至少观察30分钟,观察过敏反应主要征状,判断过敏反应发生程度,计算过敏反应反生率.③PCA实验和抗体水平检测:选择致敏反应的模型动物BN大鼠,采用口服灌胃和腹腔注射两种致敏途径,每种致敏途径实验均将36只动物随机分为3组(每组雌雄各半):阴性对照组、阳性对照OVA组和Bt蛋白组.OVA组和Bt蛋白组分别给予动物5.0㎎/只和20.0㎎/只受试物.对照组给予同样容量的去离子水或生理盐水.口服灌胃途经每日一次,连续共6周;腹腔注射途径于第1天给予受试物,第7天重复一次.动物每周称重1次.两种致敏途经的模型动物分别于第0、7、14、21、28、35和42天取血,离心分离血清.另取未经受试物处理的健康动物,通过PCA实验测定特异性IgE抗体滴度;将PCA实验采集的每只大鼠的抗血清进行倍比稀释,采用ELISA方法测定血清中特异性IgE抗体水平.动物在第42天麻醉采血处死,观察并记录脾脏重量,同时进行常规组织病理学检查(HE染色).④BN大鼠T和B淋巴细胞及NK细胞百分率测定:将上述给予Bt蛋白和阳性对照OVA的BN大鼠,于第42天解剖时经腹主动脉采血,血样经EDTA-2K抗凝处理,用流式细胞仪测定T、B淋巴细胞和NK细胞百分率.数据应用CellQuest软件分析处理,计算CD??CD??、CD??CD??、CD??/CD??比值、CD161、CD45Ra百分率.⑤体外蛋白酶消化实验:将50μL Bt蛋白溶液(10.0㎎/mL)加入150μL 0.32%(w/v)胃蛋白酶和30mmol/LNaCl混合液(pH2.0)混合液中,消化0、30s、1、2、4、10、15、 60min,同时设立阳性对照OVA.消化产物经SDS-PAGE电泳分析,用考马斯亮蓝染色. 结果:(1)CrylAb蛋白制备与鉴定:利用构建有crylAb基因的大肠杆菌JM103,经DNA同源性和蛋白质N端序列同源性比较,同源性为100%.经多次电泳制备、纯化得到Bt蛋白.从苏云金杆菌库斯塔克亚种HD-1中提取蛋白,经SDS-PAGE电泳,提取较纯的Bt毒蛋白,用于制备抗体血清,测定抗体效价为1:100.并采用Western blotting方法鉴定大肠杆菌JM103表达蛋白为目的蛋白CrylAb蛋白.(2)CrylAb蛋白食用安全性评价:小鼠单次口服灌胃给予Bt蛋白:MTD为3200㎎/㎏.亚慢性毒性实验(90天喂养实验):雄性和雌性动物各处理组每周平均体重、平均体重增加量和平均每周摄食量,与对照组相比无显著性差异(P>0.05);血液学各项血液指标WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、 MCHC、PLT平均值、临床生化指标AST、ALT、ALP、BUN、CRE、GLU、T-Bil、TCHO、 TP、ALB、Na、K、Cl平均值与对照组相比无显著性差异;绝对器官重量和相对器官重量(脏体比)与对照组相比亦无差异.Ames实验:在代谢或非代谢活化条件下,Bt蛋白所诱导的菌落数随浓度的升高并无显著性增加,与对照组相比各浓度处理组菌落数无显著性差异.染色体畸变实验:处理6小时不加S9时,低、中及高浓度组的畸变率分别为0.5、 1.0及2.0%;处理24小时不加S9时,低、中及高浓度组的畸变率分别为1.5、2.0及4.0 %;处理6小时加S9时,低、中及高浓度组的畸变率分别为2.0、2.5及1.5%,与各自的阴性对照组相比,未见畸变率显著性增加.MLA实验:在非代谢活化实验中,Bt蛋白终浓度为1.25、2.50、5.00和10.00μg/mL的相对总增长率(RTG)分别为阴性对照组的95.4 %、91.6%、93.5%和94.2%,突变率(MF)分别为66.1*10??、74.7*10??、101.6*10??和98.9*10??.与阴性对照组相比,Bt蛋白各浓度组突变率未见显著增加;在代谢活化条件下, RTG分别为阴性对照组的93.5%、92.9%、94.6%和95.1%,MF分别为76.1*10??、74.7*10??、 111.6*10??和101.9*10??.与阴性对照组相比,Bt蛋白各浓度组突变率未见显著增加.小鼠体内微核实验:雄性动物阴性对照组、Bt蛋白低浓度组、中浓度组、高浓度24小时和48小时组的微核发生率均值分别为0.38%、0.31%、0.37%和0.34%及0.46%,各浓度组与阴性对照组相比,微核率未见显著性增加(P>0.05).雌性动物相应浓度组微核发生率均值分别为0.26%、0.29%、0.29%和0.27%及0.32%,与阴性对照组相比,微核率亦未见显著性增加.早期生育力和胚胎发育毒性实验:雄性与雌性大鼠均未出现与给予受试物有关的动物死亡,亦未出现明显的毒性征状.雄性动物平均体重和体重增加量以及平均摄食量,与对照组相比无显著差异.Bt蛋白对雄性大鼠的交配率、授孕率、交配成功所需时间、睾丸绝对重量、睾丸/体重比、附睾绝对重量、附睾体重比和前列腺绝对重量以及前列腺/体重比,与对照组相比亦无显著影响,睾丸、附睾和前列腺病理组织学检查未发现明显异常改变.雌性交配期前和孕期平均体重和体重增加量以及平均摄食量,与对照组相比无显著差异.雌性大鼠的交配率、受孕率、交配成功所需时间、黄体数、着床数、吸收胎数、死胎数、着床前丢失数、着床前丢失率、着床后丢失数、着床后丢失率,与对照组相比亦未见显著性差异.胚胎-胎仔发育毒性和致畸性实验:给予受试物期间动物未出现明显的毒性征状,平均体重和体重增加量以及摄食量与对照组相比,无统计学显著性差异.Bt蛋白对母体剖宫检查数据无明显影响,胎仔外观、内脏和骨骼检查均未发现异常改变.(3)致敏性研究:致敏性方法学研究结果表明,采用经口灌胃和腹腔注射两种致敏途经均可能使Balb/c小鼠、豚鼠和BN大鼠三种模型动物对OVA、BSA产生致敏反应,PCA反应阳性,且相应采血时间点血清中特异性IgE·抗体水平出现不同程度的升高.动物体重、脾脏重量和脾脏/体重比与对照组相比未见显著性差异.组织病理学检查亦未见脾脏出现异常改变. Balb/c小鼠模型采用腹腔致敏模型优于口服灌胃模型,豚鼠两种途径的致敏模型均产生致敏反应,但其产生致敏反应的机制于人类不同,BN大鼠口服和腹腔注射途径均能产生致敏反应,且与人类致敏反应机制相同.故BN大鼠为研究蛋白类物质潜在致敏性的最佳模型.ASA实验:Bt蛋白不会导致动物出现任何过敏征状PCA实验和抗体水平检测:口服灌胃和腹腔注射途径,在第7、14、21、28、35和42天,Bt蛋白组在采样各时间点PCA反应均为阴性.对照组相比,特异性IgE抗体水平无显著性差异.大体解剖结果表明,雄性动物和雌性动物脾脏重量和脾脏/体重比,与对照组相比无显著性差异(P>0.05).组织病理学镜检提示Bt蛋白组雄性与雌性动物脾脏未见明显异常.BN大鼠T和B淋巴细胞及NK细胞百分率测定:口服灌胃和腹腔注射两种途径,在第42天,Bt蛋白组与阴性对照组相比,CD??CD??、CD??CD??、CD??/CD??、CD161、CD45Ra百分率无显著性差异.体外蛋白酶消化实验:Bt蛋白经胃蛋白酶消化液消化10分钟即降解,经SDS-PAGE分析未检测到蛋白. 结论:本实验方法制备得到了纯度高、足量的CrylAb蛋白,满足后续进行Bt蛋白食用安全性研究和致敏性评价.研究结果表明,Bt蛋白未见毒性作用,也无致突变性,对大鼠生殖发育功能无潜在影响.对蛋白类物质进行潜在致敏性方法学的研究结果表明,BN大鼠是较理想的进行致敏性研究的模型动物;运用该模型和ASA实验,结合体外消化实验以及细胞免疫毒性实验对CrylAb蛋白的研究证明,CrylAb蛋白无潜在致敏性,对免疫细胞无明显毒性. 关键词 转Bt基因 Bacillus thuringiensis CrylAb蛋白 纯化 表达 SDS-PAGE Western blotting 安全性 急性毒性 亚慢性毒性 致突变性 生殖发育毒性 胃蛋白酶 致敏性