重组猪干扰素α6和β的表达及其抗口蹄疫病毒活性研究
口蹄疫已经严重危害到我国养猪业的健康和可持续发展,目前尚无特效药治疗或预防此病,因此研制开发出一种安全、高效以及抗病毒的生物学制剂显得十分重要。有研究结果显示,猪α6干扰素（Porcine interferon alpha6,PoINF-α6）和猪β干扰素（Porcine interferon beta,PoINF-β）均具有较好抗病毒活性。本研究采用分子克隆和基因工程等分子生物技术学体外制备2个重组猪干扰素蛋白,验证其生物学活性,并开展体外抗口蹄疫病毒活性试验,以期为猪口蹄疫的检测和防控提供基础参考数据。（1）为获得PoINF-α6和PoINF-β基因,分别设计1对引物,应用反转录多聚酶链式反应,以刀豆素诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出PoINF-α6和PoINF-β基因,将扩增片段连接到pcDNA3.1表达载体,经酶切鉴定和序列测定,证实克隆片段为PoINF-α6和PoINF-β基因,成功构建重组质粒pcDNA3.1-PoIFN-α6和pcDNA3.1-PoIFN-β。（2）将重组质粒pcDNA3.1-PoIFN-α6和pcDNA3.1-PoIFN-β转染CHO-S细胞,培养12 d后离心收集细胞培养上清液,经SDS-PAGE鉴定,在19 k Da和23 k Da处均有单一的目的条带。将上清液用0.22μm滤膜过滤后,按照镍亲和层析柱操作说明对重组猪α6干扰素（rPoIFN-α6）和重组猪β干扰素（rPoIFN-β）蛋白进行纯化。蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting分析,可见大小约为19 k Da和23k Da的特异性条带,与之前鉴定结果一致,表明该2个蛋白具有良好的免疫原性。（3）为探讨纯化后的rPoIFN-α6和rPoIFN-β蛋白的抗病毒活性,开展了rPoIFN-α6和rPoIFN-β在猪肾细胞（PK-15细胞）上对水疱性口炎病毒（VSV）的抗病毒效价,探讨rPoIFN-α6和rPoIFN-β对口蹄疫病毒的抗病毒效果。结果显示,rPoIFN-α6和rPoIFN-β在PK-15细胞上对VSV的抗病毒效价分别为1.7×10~7U/mg和4.5×10~7U/mg,对PK-15细胞无毒性作用。rPoIFN-α6经10~5倍稀释后,在PK-15细胞上能够抑制口蹄疫病毒A型毒株10~4TCID50和O型毒株10~3TCID50的致细胞病变作用;rPoIFN-β经10~7倍稀释后,在PK-15细胞上能够抑制口蹄疫病毒A型毒株10~4TCID50和O型毒株10~3TCID50的致细胞病变作用。此外,研究发现4.7 ng/μL的rPoIFN-α6和浓度为7 ng/μL的rPoIFN-β均可显著诱导了PK-15细胞中多个ISGs的表达。综上所述,研究结果提示rPoIFN-α6和rPoIFN-β均能有效抑制口蹄疫病毒在体外的增殖,有望在临床生产中应用于猪口蹄疫的防治。
- 作者：
- 张丽伟
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2021年
- 导师姓名：
- 齐萌；郑海学
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 猪α6干扰素；猪β干扰素；CHO悬浮细胞；表达与纯化；口蹄疫病毒
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