羊痘病毒ANK基因141.2对宿主细胞嗜性的影响及其蛋白表达
羊痘病毒是羊痘的病原体,是毒力最强的动物痘病毒。对羔羊的感染率高达80%,死亡率可达100%,给养殖户的经济造成重大损失。羊痘病毒宿主范围局限,几乎不发生种间交叉感染。然而,进入21世纪以来,羊痘病毒跨种传播（绵羊痘病毒感染山羊或山羊痘病毒感染绵羊）的报道时有发生,还有其感染人的报道。羊痘病毒突破种间屏障和宿主范围广泛化现象增加了其传播的风险。有研究称痘病毒宿主范围的选择是由宿主范围因子决定的,但羊痘病毒的宿主范围因子研究还处在理论水平。据推测ANK基因可能是羊痘病毒的宿主范围因子,但目前没有实验依据。为了进一步了解ANK基因,本研究选择ANK基因141.2进行研究,为研究羊痘病毒宿主范围问题奠定基础。本研究参考山羊痘病毒株（NCBI登录号NC-004003.1）ANK基因141.2序列,运用生物信息学分析软件设计合成了ANK基因141.2的3条siRNA（siRNA141.2-208、siRNA141.2-458、siRNA141.2-769）,用Lip2000转染至羊痘病毒感染的vero细胞,用qPCR的方法选择其中干扰效果最好siRNA做下游实验;用同样的方法将效果最好的siRNA分别转染感染了不同羊痘病毒毒株的不同细胞,分别用绝对qPCR方法测定该毒株p32、RPO18IMVmembrane和IMV membrane三个保守蛋白基因核酸水平的变化,并进行生物统计学分析;后又根据绵羊痘病毒参考株分别设计了ANK基因141.2全长和抗原结构分三段的His标签融合表达引物,通过PCR扩增,分别与p ET42b载体连接,构建了相应的4个原核表达载体,测序鉴定后,对ANK141.2基因进行同源性分析。阳性质粒分别转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,37℃0.2 mol/LIPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测和鉴定目的蛋白。结果:qPCR表明siRNA458的干扰效果最好,在其作用下ANK141.2基因的表达在vero细胞中下调,差异显著（P＜0.01）);试验发现羊痘病毒SS株ANK141.2基因被干扰后在vero细胞中p32蛋白的表达量极显著上调（P＜0.01）,RPO18IMV membrane蛋白的表达量显著性上调（P＜0.05）,IMV membrane蛋白的表达量极显著性下调（P＜0.01）;羊痘病毒M1株ANK基因141.2被干扰后p32蛋白在羊睾丸细胞中p32蛋白的表达量显著下调（P＜0.05）,羊痘病毒TS株ANK基因141.2被干扰后p32蛋白在羊睾丸细胞中p32蛋白的表达量显著下调（P＜0.05）,RPO18IMV membrane蛋白的表达量显著性上调（P＜0.05）,但在293T细胞和vero细胞中这三种蛋白的表达量无论是干扰前还是干扰后变化不显著。PCR扩增出锚蛋白141.2全长1344 bp,各分段分别为677 bp,713 bp,545 bp,成功构建了原核表达载体p ET42b-141.2、p ET42b-141.2-1、p ET42b141.2-2、p ET42b-141.2-3;诱导表达后经SDS-Page检测表明ANK141.2基因全长未表达,3个分段表达的目的蛋白大小为24KDa,26 KDa,18 KDa左右,Western Blot鉴定均为阳性。综上所述,ANK基因141.2干扰后对不同细胞中羊痘病毒相关基因的表达具有调控作用,也为后续探究羊痘病毒跨物种传播分子机理提供参考依据,构建ANK基因141.2重组质粒为后续制备多克隆抗体做准备。
- 作者：
- 高娜
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2021年
- 导师姓名：
- 李有文
- 中图分类号：
- S858.26
- 关键词：
- 羊痘病毒；宿主范围因子；RNA干扰
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- 基金项目：
- 国家自然科学基金项目“基于宿主范围基因ANK的山羊痘病毒跨物种感染的分子机制研究”的部分研究成果（项目编号:31760741）,课题主持人:李有文教授（塔里木大学）