苹果砧木原生质体的高效制备和融合
本试验以八棱海棠成熟胚为材料,进行八棱海棠组织培养,主要研究了不同激素及配比对八棱海棠组培苗扩繁、生根及离体叶片愈伤组织诱导、增殖的影响,建立了八棱海棠胚高效再生无菌体系,为工业化生产提供技术支持,并为原生质体的制备提供材料。原生质体已被证明是现代植物生物学的有力介质。然而,成功制备大量可存活的原生质体仍然是苹果属面临的挑战。本研究以八棱海棠组培苗和M9-T337实生幼苗为材料,通过优化酶解条件,分别建立了原生质体分离纯化体系,并进行原生质体融合的研究,筛选出两种砧木最适原生质分离纯化及融合的条件和方法。为苹果属植物的体细胞杂交研究和种质资源创新提供了理论基础。主要研究结果如下:1、八棱海棠组织培养再生体系的建立（1）八棱海棠外植体最优的消毒处理为,剥除种皮前:75%乙醇/30 s+10%Na Cl O/10 min,剥除种皮后:10%Na Cl O/1 min,可将种子的污染率降至0%,且发芽率最高为93%;八棱海棠组培苗最适增殖培养基为:MS+2.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA,增殖系数为4.11,苗高为2.57 cm;组培苗最适生根培养基为:1/2 MS+0.7 mg/LIBA+0.5 mg/LNAA,生根率达到100%,平均根长为7.97 cm,主根数为8.33条,根系表面积为54.71 cm~2,根尖数为572.27个,平均株高3.42 cm;叶片愈伤组织最适诱导培养基为:MS+0.1 mg/LTDZ+1.0 mg/LNAA和MS+2.5 mg/L2,4-D,诱导率分别为94.70%和91.33%,可诱导出不同状态的愈伤组织;愈伤组织最适增殖培养基为:B5+0.5 mg/L6-BA+0.2mg/LIBA,最适继代时间为28±2 d。2、原生质体分离体系的建立（1）八棱海棠叶片原生质体最佳酶解处理为,将材料浸没在酶液组合为1.0%纤维素R-10（Cellulase R-10）+0.2%果胶酶Y-23（Pectolyase Y-23）+0.65 mol/L甘露醇中,调节p H为5.6,在黑暗条件下,35 rpm、25℃酶解10 h后,再利用25%蔗糖-13%甘露醇密度梯度离心法纯化原生质体,可以获得杂质少、产量高、活性强的原生质体。（2）M9-T337叶片原生质体最佳酶解处理为,酶解材料先经过13%甘露醇CPW盐溶液处理1 h后,再进行酶解,可显著提高原生质体的产量和活力。最佳酶液组合为:1.0%纤维素R-10（Cellulase R-10）+0.3%果胶酶Y-23（Pectolyase Y-23）+0.7 mol/L甘露醇,调节p H为5.6,在黑暗条件下,35 rpm、25℃酶解10 h,可以获得高质量的原生质体。3、原生质体融合体系的建立以纯化后的八棱海棠、M9-T337的原生质体为材料,选择PEG-高Ca2+-高p H结合融合法进行融合试验,最佳PEG-6000浓度为35%,最佳融合时间为25 min,可获得融合体,融合率最高为4.57%。
- 作者：
- 雷富臣
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2022年
- 导师姓名：
- 王新建
- 中图分类号：
- S661.1
- 关键词：
- 八棱海棠；M9-T337；组织培养；原生质体；PEG融合
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- 基金项目：
- 兵团重大科技项目“苹果矮化省力优质高效栽培技术集成与示范”项目的部分研究成果（项目编号:2016jb03-3）课题主持人:王新建教授（塔里木大学）