重组猪γ干扰素的制备及其抗塞内卡病毒活性研究
干扰素-γ（Interferon-gamma,IFN-γ）是一种在先天性和适应性免疫调节中能够起多种作用的细胞因子,还具有抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫和抗癌等生物学活性,已被开发为用于临床的免疫调节药物。已有研究表明,重组猪γ干扰素（rPoIFN-γ）能够显著抑制病毒在动物体内的复制。我国作为养猪大国,A型塞内卡病毒（Senecavirua A,SVA）能引起母猪水疱性疾病和新生仔猪急性死亡综合征,感染新生仔猪后死亡率高达70%～80%,已经严重威胁到养猪业的发展。因此,利用基因工程开发具有低成本高活性的抗病毒药物和免疫增强药物尤为重要。本研究采用CHO细胞表达系统生产具有高生物活性的rPoIFN-γ,以SVA为模型病毒分析其体外抗病毒活性,为rPoIFN-γ的功能研究和猪病毒性疾病控制剂的开发提供材料和奠定基础。本研究根据Gen Bank中的猪IFN-γ基因序列合成目的基因片段;合成的目的片段和pc DNA3.1载体质粒分别双酶切后连接,重组质粒经双酶切和测序鉴定;重组质粒pc DNA3.1-Po IFN-γ转染至悬浮培养的CHO细胞中,收集后的上清经镍离子亲和层析柱纯化后,利用SDS-PAGE和Western blot检测技术确定蛋白表达情况。结果显示:酶切和测序结果显示重组质粒pc DNA3.1-Po IFN-γ构建成功;蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测分析,27 k Da左右出现特异性蛋白条带且重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。为检测纯化的rPoIFN-γ的抗病毒活性,通过CCK-8法检测rPoIFN-γ对IBRS-2细胞的毒性作用;通过VSV/PK-15系统,采用细胞病变抑制法（CPEI）测定rPoIFN-γ对水疱性口炎病毒（VSV）的抗病毒效价,探讨rPoIFN-γ对SVA的抗病毒效果;通过病毒滴度测定、q PCR和Western-blot检测rPoIFN-γ在IBRS-2细胞上对SVA的复制作用;通过q PCR检测rPoIFN-γ诱导IBRS-2细胞ISGs和细胞因子表达情况。结果显示:rPoIFN-γ对IBRS-2细胞无毒性作用;rPoIFN-γ在PK-15细胞上对VSV的抗病毒效价为5.59×10~7U/mg,rPoIFN-γ抗SVA活性效价为6.87×10~6U/mg。rPoIFN-γ能够显著抑制SVA在IBRS-2细胞的复制（P＜0.01）。rPoIFN-γ处理IBRS-2细胞后17种ISGs和细胞因子的表达水平均显著升高（P＜0.01）。本研究成功制备rPoIFN-γ,并证明其具有较低的细胞毒性和较高的抗病毒活性效价,为rPoIFN-γ的功能分析及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和研究基础。
- 作者：
- 王凌云
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2023年
- 导师姓名：
- 井波；郑海学
- 中图分类号：
- S859.797
- 关键词：
- 重组猪IFN-γ；A型塞内卡病毒；CHO细胞；蛋白表达与纯化；抗病毒活性
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- 基金项目：
- 甘肃省科技重大专项计划,项目编号:21ZD3NA001课题主持人:郑海学研究员（塔里木大学）%中国农业科学院所级重点任务,项目编号:1610312021013课题主持人:郑海学研究员（塔里木大学）%中国农业科学院兰州兽医研究所所级基本科研业务费”（项目编号:1610312022009）课题主持人:郑海学研究员（塔里木大学）