羊布鲁氏菌病IFN-γ双夹心ELISA方法的建立及初步应用
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的重要人畜共患传染病,其对我国牛羊养殖造成明显的经济损失,对相关从业人员健康构成严重威胁。准确诊断是布病防控的重要环节,但因布鲁氏菌感染后无明显的示病症状,感染早期难以被发现。血清学检测是国内外布鲁氏菌病诊断最常用手段,但不同检测方法在操作的便捷性,检测的敏感性、特异性方面各有优缺点,尚无法单靠一种血清学方法对布鲁氏菌病进行确诊。IFN-γ释放试验是WOAH推荐的布鲁氏菌病确诊的补充方法,具有敏感性高、特异性好的特点,我国亟须建立相应的检测方法。本研究将羊IFN-γ蛋白基因与原核表达载体p Cold II连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经过低温和IPTG诱导表达。将带有m Cherry标签的融合表达目的蛋白基因CIFN-γ与真核表达载体p Fast Bac HT B连接,构建Sf9细胞表达系统。用2种系统表达的目的蛋白分别免疫小鼠,制备抗羊IFN-γ单克隆抗体结果表明,构建的2种表达系统都能够有效表达目的蛋白,大肠杆菌表达系统能够可溶性表达羊IFN-γ蛋白,经Ni-NTA柱纯化后的目的蛋白纯度在60%以上,Sf9细胞表达的羊IFN-γ蛋白经Ni-NTA柱纯化,纯度达70%以上。Sf9细胞表达的目的蛋白免疫小鼠组成功筛选到5株稳定分泌抗羊IFN-γ单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定4株的抗体亚型为Ig G2b,1株抗体亚型为Ig M,其中4Z10杂交瘤细胞制备的小鼠腹水抗体效价最高为1:32000。同时,用原核表达的羊IFN-γ蛋白免疫家兔制备兔抗羊IFN-γ多克隆抗体,纯化后效价为1:64000。利用制备的单克隆抗体和兔抗羊IFN-γ多克隆抗体,通过棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最佳作用浓度,优化ELISA包被及反应条件。然后筛选最佳布鲁氏菌IFN-γ释放刺激原,完善羊布鲁氏菌病IFN-γ体外释放试验方法。最后将建立的双抗体夹心ELISA方法初步应用于布鲁氏菌S2疫苗免疫的羊群的检测,检测结果与虎红平板凝集试验和竞争ELISA方法进行比较。主要实验结果如下:（1）捕获抗体使用1:4000稀释的多抗,检测抗体使用1:2000稀释的HRP标记的单抗,建立羊IFN-γ双夹心ELISA检测方法,检测最低羊IFN-γ的浓度为1.25 ng/m L。（2）布鲁氏菌S2株菌素为羊布鲁氏菌病IFN-γ体外释放试验最佳刺激原。（3）将建立的羊布鲁氏菌病IFN-γ双抗体夹心ELISA方法应用于S2疫苗免疫的羊群中,与虎红平板凝集试验和竞争ELISA相比,在感染早期的阳性检出率最高。
- 作者：
- 李林姣
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2023年
- 导师姓名：
- 李俊平
- 中图分类号：
- S858.26
- 关键词：
- 羊布鲁氏菌病；IFN-γ；单克隆抗体；多克隆抗体；双夹心ELISA
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- 基金项目：
- “十四五”国家重点研发计划2022YFD18006