猪O型口蹄疫病毒遗传进化分析及“安全种毒”的研制
口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是一种由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的急性、热性、高度传染性的重大动物疫病,曾多次在世界范围内流行,对全球畜牧业造成严重冲击,我国将其列为一类动物疫病。“安全种毒”是以专利“口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体”为基础,插入流行毒株的结构蛋白从而构建一种新的嵌合病毒,该嵌合病毒缺失了FMDV毒力蛋白Lpro,在自然条件下不发生毒力返强,并且对乳鼠、猪和牛的致病力大大降低或无致病力,安全性高,故称其为“安全种毒”。本研究通过比较我国猪O型口蹄疫疫苗毒株与亚洲地区O型口蹄疫流行毒株的遗传进化情况、预测亚洲地区O型口蹄疫病毒的优势拓扑型,在口蹄疫灭活疫苗“安全种毒”载体的基础上研制了O/Cathay拓扑型的“安全种毒”,为用“安全种毒”替代强毒生产口蹄疫灭活疫苗、研制预防未来口蹄疫流行的口蹄疫“安全种毒”疫苗提供数据支持。比较我国猪口蹄疫疫苗毒株O/Mya98/XJ/2010、O/GX/09-7与原始种毒Mya98-11、Cathay-7的抗原位点氨基酸差异情况,发现疫苗毒株在BHK-21细胞传代过程中发生了不同程度的变异,同源性为93.6%-99.2%;自GenBank公共数据库获取亚洲地区O/Mya98、O/Cathay拓扑型毒株全基因组序列823条,根据宿主划分为314条牛源FMDV、509条猪源FMDV,比较得知牛源FMDV、猪源FMDV VP1区有21个宿主特异性氨基酸差异位点且宿主特异性氨基酸差异位点的优势氨基酸类型不同;比较我国猪口蹄疫疫苗毒株O/Mya98/XJ/2010、O/GX/09-7与亚洲地区O/Mya98、O/Cathay拓扑型毒株,在21个宿主特异性氨基酸差异位点的氨基酸差异情况,发现O/Cathay拓扑型的O/GX/09-7疫苗毒株与猪源FMDV的优势氨基酸类型保持一致,O/Mya98的O/Mya98/XJ/2010的疫苗毒株与牛源FMDV优势氨基酸类型保持一致。这为鉴别疫苗毒株与流行毒株宿主匹配性、种属特异性积累基础数据,也为未来研究牛源毒适应猪、猪源毒适应牛等毒株跨种传播提供了数据参考。自公共数据库获取亚洲地区O型口蹄疫病毒基因序列3396条,针对VP1基因构建系统发育进化树,通过划分病毒拓扑型,统计分析不同拓扑型的时间分布特征与占比情况,发现Cathay、ME-SA与SEA拓扑型是亚洲地区最为优势流行的三种O型口蹄疫病毒拓扑型;评估基因序列数据集的时间信号强度,发现亚洲地区Cathay、ME-SA及SEA拓扑型的基因序列数据均具有较强的时间信号;对病毒进化动态进行分析,计算不同优势流行拓扑型的进化速率,发现三种拓扑型中Cathay具有相对最高的分子进化速率,为1.1×10-2核苷酸变异/位点/年,而ME-SA、SEA的进化速率则相对降低,分别为0.9×10-2、0.7×10-2核苷酸变异/位点/年;分析比较病毒遗传多样性变化轨迹等进化动力学特征,结果表明Cathay拓扑型的遗传多样性水平在近十年间明显逐渐升高,说明Cathay拓扑型在亚洲地区的传播流行呈现扩张发展的态势。口蹄疫灭活疫苗生产工艺中,存在潜在的强毒泄露、扩散引起口蹄疫疫情的风险,鉴于Cathay拓扑型在亚洲地区的传播流行呈现扩张发展的态势,因此将具有潜在威胁的O/Cathay拓扑型口蹄疫病毒结构蛋白VP2、VP3和VP1基因,通过SspI和SgrAI酶切,插入口蹄疫灭活疫苗“安全种毒”载体p43-CHA90-LL,构建“安全种毒”质粒p43-LL-Cathay;通过转染BHK-21细胞拯救口蹄疫“安全种毒”v43-LL-Cathay,并对该“安全种毒”TCID50、LD50等生物学特性进行了测定。结果显示,构建“安全种毒”质粒p43-LL-Cathay鉴定正确,“安全种毒”/亲本毒株F3代TCID50分别为10-4.7/0.1ml、10-6.8/0.1ml、“安全种毒”对乳鼠致病力小于10-3.0/0.2ml,亲本毒株LD50为10-5.8/0.2ml,“安全种毒”感染力低于亲本毒株,该“安全种毒”有望成为一株潜在的预防未来口蹄疫流行的疫苗毒株。
- 作者：
- 马建荣
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2023年
- 导师姓名：
- 朱元源
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 口蹄疫病毒；遗传进化；安全种毒
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- 基金项目：
- “十四五”国家重点研发计划2021YFD1800300