鹿茸MSCs和EpSCs共培养及对小鼠皮肤外伤治疗效果的研究
鹿茸为生长于公鹿额部的再生性附属器官,其快速生长基于干细胞的增殖分化。茸皮附着于茸骨之上,每年鹿角再生时,脱盘后的伤口起于茸皮组织的快速愈合,并在茸生长过程对其牵拉刺激鹿茸的快速生长。茸皮是鹿茸MSCs生长的微环境,鹿茸的生长发育以及茸骨脱落后伤口再生性愈合都与茸皮有着密切联系。为探讨鹿茸MSCs与茸皮EpSCs的基本特性及对皮肤外伤的治疗的效果,本试验以鹿茸MSCs和茸皮EpSCs为试验材料,通过体外共培养研究其生长特性,基本形态指数等生物学特征;建立共培养体系分析鹿茸MSCs对茸皮EpSCs增殖、迁移的影响;利用静脉注射共培养细胞研究对鼠皮肤外伤的治疗效果。研究结果为鹿茸MSCs的进一步开发利用奠定基础,也为茸皮EpSCs对皮肤外伤临床修复提供新的理论基础与研究思路。试验一,为研究塔里木马鹿茸间充质干细胞（MSCs）的生物学特征。体外培养小鼠骨髓和鹿茸两种来源MSCs,比较其生长特性,利用光学显微镜和透射电镜对细胞形态特征、结构、细胞器组成和数量进行比较。鹿茸MSCs呈梭形,排列规律,形态均一;鼠BMSCs形态不规则,呈三角形,多边形等;鹿茸MSCs胞体、胞核面积分别为963μm~2和134μm~2,极显著高于鼠BMSCs的551μm~2和79μm~2（P＜0.01）;鹿茸MSCs的核质比为0.167,显著低于鼠BMSCs的0.206（P＜0.05）;鹿茸MSCs体外培养呈“S”形生长趋势,增殖速度极显著高于鼠BMSCs（P＜0.01）。超微结果显示鹿茸MSCs胞体面积较大,细胞器种类简单,线粒体、内质网等细胞器形态具备早期幼稚细胞发育特征。塔里木马鹿茸MSCs增殖能力高于小鼠,在临床治疗中具备更广泛的应用优势。试验二,通过Ⅳ型胶原分选获得塔里木马鹿茸茸皮EpSCs,成功建立了茸皮EpSCs的体外培养体系。β1整合素、和CK19染色后细胞均呈阳性高表达;EpSCs P1在传代第1d细胞生长处于滞留期,第2-4d细胞缓慢生长,第5d开始细胞进入对数生长期;P3、P5细胞从第1d即开始缓慢增长,至第5d细胞进入指数增长期。接种密度相同情况下P1、P3、P5细胞生长趋势相同,均呈“S”型增长,但P1细胞生长趋势快于P3、P5。在体外培养过程中发现,比较茸皮EpSCs贴壁速度与鹿茸MSCs没有差异,但茸皮EpSCs有丝分裂速度慢,细胞融合时间较长。试验三,为了弥补茸皮EpSCs生长缓慢的缺陷,提高细胞体外培养效率,将鹿茸MSCs与EpSCs进行不同细胞比例（即1:1,1:3和3:1）共培养试验。结果发现鹿茸MSCs与茸皮EpSCs细胞数目比例为3:1时共培养组细胞相容性较好、数量更多,在24h-72h细胞增殖速率均极显著高于EpSCs,（P＜0.01）,通过比较β1整合素、和CK19荧光强度和CCK8阳性细胞数目证实其对EpSCs增殖有显著促进作用,划痕试验显示在划痕的24h-72h里鹿茸MSCs对茸皮EpSCs迁移具有显著促进作用（P＜0.01）。鹿茸MSCs对茸皮EpSCs有显著促增殖、迁移作用。试验四,我们发现鹿茸MSCs与茸皮EpSCs在体外共培养对EpSCs增殖、迁移具有显著促进作用,因此选用共培养最优组（3:1）,对小鼠背部全层皮肤缺损模型进行治疗,与生理盐水组、自然愈合组相比较,第3d共培养细胞治疗组的创伤面积（20.1±0.75 mm~2）较自然愈合组（27.5±2.7 mm~2）和生理盐水组（26.3±1.7 mm~2）显著减小（P＜0.01）;第7d共培养细胞治疗组伤口面积（10.8±3.1 mm~2）持续显著缩小（P＜0.01）,第9d、12d治疗组伤口面积分别愈合至5.4±2.7 mm~2和2.5±0.97 mm2,均显著低于对照两组（P＜0.01）。说明鹿茸MSCs与茸皮EpSCs在体外共培养组能够明显促进小鼠皮肤创伤愈合。综上所述,鹿茸MSCs具备早期幼稚细胞发育特征并有很强的增殖能力,与茸皮EpSCs共培养能够明显促进EpSCs的增殖与迁移;在皮肤外伤治疗中参考鹿茸MSCs治疗效果,鹿茸MSCs与茸皮EpSCs共培养能够明显的促进皮肤外伤的愈合。
- 作者：
- 张荠允
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2023年
- 导师姓名：
- 韩春梅
- 中图分类号：
- S825；R285.5
- 关键词：
- 鹿茸MSCs；茸皮；EpSCs；细胞共培养；皮肤创伤愈合
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- 基金项目：
- 国家自然科学基金项目“创伤微环境HGF/c-Met信号对鹿茸间充质干细胞增殖、迁移与分化的调控机制”（项目编号:31860629）课题主持人:韩春梅教授（塔里木大学）