流式分选比利时蓝牛X、Y精子的效果研究
流式分选X、Y精子并用预知性别精子进行人工授精是当前动物性别控制的主流技术。分选冷冻精液低剂量人工授精或性控胚胎移植在奶牛上已经商业化应用,且分选效果稳定可靠。肉牛精子活率和密度等主要指标均低于奶牛,同时比利时蓝牛精子分选相比奶牛难度较高,需要建立有效的分选体系来提高分选效率。本研究对比奶牛和其他肉牛精液分选技术,筛选并优化分选参数,建立比利时蓝牛精液分选体系;对分选后精液进行生物学及后代健康评价,为精液流式分选技术的高效性、安全性和产业化推广提供理论依据。本研究的主要结果如下:（1）为了建立有效的比利时蓝牛X、Y精子分选技术体系。本试验通过调整和优化分选参数,采用不同浓度（36、38、40、42、44μg/m L）的Hoechst33342对精液进行染色,同时设置不同设门指数（91、93、95、97%）进行分选,共同探讨不同染料浓度和设门指数对精子分选效果的影响;利用流式重分析法检测分选精子纯度,对分选精液进行品质评定。结果发现:当Hoechst33342浓度为42μg/m L以及设门指数为95%时能有效地将X和Y精子稳定分离,同时发现由于部分公牛精液畸形率较高或仪器无法识别导致无法分选。重分析法检测X、Y精子纯度分别为94.4%和90.8%,解冻后X和Y精子活率（38.44±0.69%vs 40.65±0.83%）等主要指标与常规精子（41.75±1.21%）之间差异不显著（P＞0.05）。（2）为了研究分选精子DNA和RNA完整性。本试验采用SCD法检测不同品种公牛性控精子DNA完整性;提取精子RNA,反转录c DNA及精子RNA质量验证,RT-PCR检测不同品种公牛性控精子RNA完整性。结果发现:比利时蓝牛性控精子DNA完整性与其他品种公牛性控精子差异不显著（P＞0.05）,且SCD法检测可以作为评价公牛精子质量的有效方法。提取精子RNA纯度较高,无其他非精子细胞的污染,RT-PCR结果显示比利时蓝牛性控精子RNA完整性与其他品种公牛性控精子差异不显著。（3）为了验证分选精液的应用效果。本试验使用不同品种公牛性控精液对供体母牛超数排卵获得可用性控胚胎,随后进行移植;对同期发情处理的青年母牛使用性控精液进行人工授精,在授精后进行受胎率、产犊率、后代性别比例和初生重检测。结果发现:移植后性控胚胎产犊率（38.9%vs 35.3%vs 40.0%）与常规胚胎（40.9%）差异不显著（P＞0.05）,性控胚胎后代性别比显著偏离常规胚胎;人工授精性控精液受胎率（46.9%vs 46.4%vs 47.8%）与常规精液（51.9%）差异不显著,性控精液后代性别比显著偏离常规精液,以及雌性与雄性后代初生重差异皆不显著。综上所述,本研究通过流式分选技术建立有效的比利时蓝牛X、Y精子分选体系,分选精液品质鉴定和遗传物质完整性检测结果均满足试验和生产要求,并且人工授精与胚胎移植试验可以达到较高的受胎率及产生预知性别后代,为进一步提高性控精液的生产应用提供理论和试验数据支持。
- 作者：
- 牛鹏
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2023年
- 导师姓名：
- 高庆华
- 中图分类号：
- S823
- 关键词：
- 比利时蓝牛；流式分选；精子DNA；精子RNA；性别比例
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- 基金项目：
- 兵团财政科技计划项目“南疆肉牛群体质量提升关键技术研究”（项目编号:2021BBO11）,课题主持人:高庆华教授（塔里木大学）%2021年塔里木大学校级研究生创新项目“比利时蓝牛X、Y精子分选与人工授精效果分析”（项目编号:TDGRI202135）,课题主持人:牛鹏（塔里木大学）