饮食黄酮漆黄素改善病理性心肌重构的机制研究

漆黄素为一种天然的饮食类黄酮,主要存在于苹果、柿子、葡萄、草莓、黄瓜等各种水果和蔬菜中,具有强大的抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及保护心肌和脑缺血性损伤等作用。近年来,漆黄素因与靶向清除衰老细胞的药物槲皮素结构类似而备受关注,可作为饮食限制的模拟药物延缓大鼠多种器官的衰老。线粒体质量控制失调被认为是导致心脏衰老以及病理性心肌重构的重要因素,而漆黄素能否通过调控线粒体质量改善病理性心肌重构,目前尚未见相关报道。目的:探讨饮食黄酮漆黄素在病理性心肌重构中的作用及其相关机制,为漆黄素治疗心肌肥厚及纤维化提供充分的理论依据。方法:异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）诱导体外培养心肌细胞肥大模型的建立。将H9c2细胞分为空白对照组、模型（ISO）组、漆黄素组、漆黄素+ISO组、漆黄素+ISO+Compound C组以及漆黄素+ISO+Ex-527组。模型组用30μM ISO刺激细胞48 h;漆黄素组于ISO刺激前30 min给予20μM漆黄素预处理;AMPK抑制剂组于漆黄素干预的同时在细胞培养液中加入10μM Compound C;Sirt1抑制剂组于漆黄素干预的同时在细胞培养液中加入10μM Ex-527;对照组给予不含药物的溶剂处理。CCK-8试剂盒检测漆黄素和ISO对心肌细胞的毒性,确定最佳的漆黄素治疗浓度与ISO造模浓度;FITC鬼笔环肽/DAPI复合荧光染色法检测心肌细胞的表面积;DCFH-DA荧光探针检测线粒体ROS生产;JC-1试剂盒测定心肌细胞线粒体膜电位水平。Mito Tracker?Red标记线粒体,观察线粒体形态与数量;Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡;荧光定量PCR检测心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和β-MHC m RNA表达水平与线粒体拷贝数量;蛋白质免疫印迹法检测线粒体分裂/融合相关蛋白、线粒体未折叠蛋白反应相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白以及内质网应激相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。雄性C57/BL6小鼠40只随机分为四组:Saline组、ISO组（20 mg/kg/d）、漆黄素对照组和漆黄素治疗组（25 mg/kg/d）,每组10只。ISO采用皮下注射,每天一次,共28 d,诱导病理性心肌重构模型。另取C57/BL6小鼠40只,随机分为假手术组（Sham）、Sham+漆黄素组、胸主动脉缩窄（Thoracic aortic constriction,TAC）组、漆黄素治疗组（TAC+漆黄素）。术后28 d采用小动物超声检测小鼠心功能,HE、WGA、天狼星红或Masson染色及免疫组化染色观察心脏大体病理、心肌细胞肥大以及心肌纤维化表型;Tunel染色检测心肌细胞凋亡;荧光定量PCR检测心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC m RNA水平,蛋白质免疫印迹法分析相关蛋白变化。结果:漆黄素浓度在5～40μM范围内对离体培养H9c2心肌细胞活性无明显影响,而当漆黄素浓度为50μM时H9c2细胞活力开始出现明显降低（P＜0.01）。与对照组相比,30μM ISO处理48 h可明显诱导心肌细胞肥大,ANP、BNP和β-MHC m RNA表达水平、心肌细胞表面积以及线粒体ROS水平明显增加（P＜0.05）,线粒体膜电位显著降低。Mito Tracker?Red染色、PCR以及蛋白质免疫印迹结果提示模型组心肌细胞内质网应激明显增加,线粒体分裂呈碎片状,拷贝数明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比,漆黄素能够显著降低ISO诱导心肌细胞肥大标志物ANP、BNP、β-MHC m RNA水平和心肌细胞表面积增加,降低心肌细胞凋亡水平以及线粒体ROS含量,升高线粒体膜电位水平（P＜0.05或P＜0.01）。此外,漆黄素干预组心肌细胞线粒体拷贝数明显增加,碎片状线粒体数量减少,网状线粒体明显增多（P＜0.01）。漆黄素干预能明显逆转内质网应激相关蛋白表达的增加,增加线粒体融合蛋白OPA1、Mfn2、UPR^mt相关蛋白Lon P1及线粒体自噬蛋白Pink1、Parkin表达,与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。AMPK抑制剂Compound C和Sirt1抑制剂Ex-527能明显拮抗饮食黄酮漆黄素对ISO诱导离体培养心肌肥大的保护,增加ANP、BNP和β-MHC m RNA水平和心肌细胞表面积,激活ER应激并抑制UPR^mt（P＜0.05或P＜0.01）。动物实验结果:ISO皮下注射和TAC术后28 d可明显诱导小鼠心脏病理性重构,心肌细胞横截面积、HW/BW以及HW/TL较假手术相比均明显增加,心肌纤维化增多（P＜0.05）。小动物超声显示模型组小鼠左室射血分数（LVEF%）与左室短轴缩短率（LVFS%）显著下降（P＜0.05）,左室收缩期内径（LVIDs）、左室舒张期内径（LVIDd）、左室收缩期容积（LVOLs）和左室舒张期容积（LVOLd）明显增大（P＜0.05）。与模型组相比,漆黄素处理组小鼠心脏结构和功能均得到明显改善,LVEF%和LVFS%明显升高（P＜0.05）,LVIDs、LVIDd、LVOLs、LVOLd、HW/BW值和HW/TL值均显著降低（P＜0.05）。病理染色结果提示,漆黄素处理可显著改善ISO皮下注射和TAC手术诱导小鼠心肌肥厚及纤维化,抑制心肌细胞的凋亡（P＜0.05）。心肌肥大标志物ANP、BNP、β-MHC m RNA水平明显降低（P＜0.05）。此外,漆黄素还可明显抑制肥厚心肌内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、Calreticulin和线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1表达,上调线粒体融合蛋白Mfn2、OPA1、线粒体自噬蛋白Pink1、Parkin及UPR^mt相关蛋白Lon P1,与模型组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论:饮食黄酮漆黄素能明显减轻内质网应激诱导的心肌损伤,增强线粒体融合、线粒体自噬和UPR^mt,抑制病理性心肌重构。漆黄素通过AMPK/Sirt1信号通路调节UPR^mt和内质网应激等,从而控制线粒体质量,逆转小鼠病理性心肌重构。