牛雌性和雄性囊胚转录组测序及差异表达基因研究
哺乳动物在性腺确定和发育之前,雌性和雄性胚胎在增殖分化方面已表现出差异。牛雄性囊胚较雌性囊胚发育更快,这与两性胚胎之间的转录差异有关。胚胎中微量的RNA无法满足常规转录组测序文库构建的基本要求,而单细胞转录组测序(sc RNA-seq)技术允许在单个胚胎水平上分析基因表达,成为研究两性胚胎转录组差异的有效工具。本研究通过超微量DNA模板巢式扩增牛牙釉质基因(AMEL)序列片段鉴定胚胎性别,以确定性别的牛体内雌性和雄性囊胚为试验材料,通过Smart-seq2扩增技术构建单个胚胎转录组测序文库,应用Illumina Hi Seq Xten高通量测序平台进行sc RNA-Seq,通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异表达基因(DEGs)进行分类,鉴定与雌雄囊胚增殖差异有关的DEGs。同时,本研究还克隆筛选出基因(SLC22A14)的CDS序列,并进行生物信息学分析,检测其在牛体内雌性和雄性囊胚中的表达情况。主要研究工作及结果如下:1.优化巢式扩增牛牙釉质基因(AMEL)DNA序列片段鉴定胚胎性别技术体系。根据Gen Bank中牛AMEL基因(AMELX和AMELY)序列设计引物,析因法建立巢式PCR体系,经10倍梯度稀释法稀释的性别特异性(雌性和雄性)血液g DNA测试引物特异性和灵敏度后,用显微玻璃针抽吸5～8个胚胎内细胞团(ICM),经蛋白酶K裂解后直接用作巢式PCR模板进行性别鉴定,而不采用传统的DNA分离方法。本研究建立的牛胚胎性别鉴定体系灵敏度可以达到10 pg,对胚胎性别确定的准确率为100%(16/16)。2.构建牛体内单个雌性和雄性囊胚的转录组测序文库并进行sc RNA-Seq。利用优化后的胚胎性别鉴定体系确定牛体内囊胚的性别,以确定性别的囊胚为试验材料,采用Smart-seq2扩增技术构建单个胚胎测序文库,应用Illumina Hi Seq Xten高通量测序平台进行sc RNA-Seq,使用HISAT2、String Tie和DEseq2软件包筛选、组装和比较转录组数据,并进行基因差异表达分析、GO功能分析和KEGG通路分析。两组之间共鉴定出8 004个DEGs,包括3 102个上调基因和4 902个下调基因。GO注释发现雌性囊胚上调基因显著富集在核苷酸结合、信号转导调控、多细胞生物发育等条目,雄性囊胚上调基因显著富集在氧化磷酸化、线粒体、核糖体等条目。KEGG富集分析发现与雌性和雄性囊胚增殖差异相关的通路有代谢途径、糖酵解、磷酸戊糖途径、细胞衰老、氧化磷酸化、调节干细胞多能性的信号通路等。并利用GO和KEGG结果筛选出9个与雌性和雄性牛囊胚增殖差异相关的差异表达基因:SLC22A14、DNMT3A、GADD45G、MRPL1、G6PD、HPRT1、FHL2、CAPN6、FBP1。3.克隆差异表达基因SLC22A14的CDS序列,并检测其在牛体内雌性和雄性囊胚中的表达。采用一步法合成和预扩增了单个胚胎的c DNA,通过克隆测序获得牛SLC22A14基因CDS序列。结果显示牛SLC22A14基因CDS区共1941 bp,编码646个氨基酸。生物信息学分析显示SLC22A14蛋白为不稳定疏水蛋白,有12个跨膜结构域和56个磷酸化位点,无信号肽。实时荧光定量PCR结果显示,SLC22A14基因在雄性囊胚中的表达量显著高于雌性囊胚(P<0.05)。综上,本研究成功构建了牛单个雌性和雄性囊胚的转录组测序文库,并利用sc RNA-Seq技术获得了牛囊胚的转录组数据。雌性囊胚上调基因在与胚胎的新陈代谢速率相关,尤其是与控制氧自由基数量和葡萄糖消耗相关的通路显著富集,而雄性囊胚上调基因在与氧化磷酸化、线粒体和核糖体有关的通路显著富集,使得雄性囊胚较雌性囊胚具有更快的发育。另外,实时荧光定量PCR结果显示,SLC22A14基因在雄性囊胚中的表达量显著高于雌性囊胚。这将为进一步研究雌性和雄性胚胎增殖分化差异机理提供参考。
- 作者：
- 崔宝山
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 专业名称：
- 畜牧学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2023年
- 导师姓名：
- 高庆华
- 中图分类号：
- S823
- 关键词：
- 囊胚；单细胞转录组测序(scRNA-Seq)；差异表达基因；富集分析
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- 基金项目：
- 国家自然科学基金项目“牛SRY基因促进雄性卵裂期胚胎增殖分化的分子机理研究”(项目编号:31660657)课题主持人:高庆华 教授(塔里木大学)