屎肠球菌筛选及其对绵羊营养物质消化、瘤胃发酵和免疫的影响

本试验通过体外法筛选屎肠球菌在绵羊中的最适添加水平,以枯草芽孢杆菌作为比较,添加于绵羊饲料中,研究屎肠球菌和枯草芽孢杆菌对绵羊营养物质消化、瘤胃发酵和免疫的影响,比较二者单菌添加及其复合益生菌剂添加的效果,为屎肠球菌在反刍动物饲料添加剂上的应用提供科学依据,为健康养殖提供思路。本研究通过体外试验和体内试验,体外试验中将不同活菌数的屎肠球菌添加至绵羊瘤胃液中,筛选屎肠球菌的适宜添加量,体内试验为预饲期15 d,正饲期60 d的饲养试验,正饲期分为第0～30 d（Ⅰ期）和第31～60 d（Ⅱ期）,于每期第1-3 d采集不同时间点的瘤胃液,分析瘤胃发酵指标,每期第5～12 d进行消化试验,测定营养物质消化率,并于每期30 d测定绵羊生产性能并采集瘤胃液,利用16S r DNA测序分析瘤胃微生物区系,第0、15、30、45和60 d晨饲前进行颈静脉采血,进行血清免疫指标的测定。并对试验数据进行整理分析。意在为探索屎肠球菌在绵羊饲料添加剂上提供科学依据。本试验包括以下5个方面:试验一:体外法筛选屎肠球菌最适添加水平本试验旨在研究不同活菌数屎肠球菌对绵羊瘤胃体外发酵参数的影响,探索最适绵羊体内添加水平。本试验采用体外产气法,设置对照组、处理1组、处理2组和处理3组,各组屎肠球菌活菌数分别为0、1×10¹² CFU/m L、1×10¹¹ CFU/m L和1×10¹⁰ CFU/m L,并分别培养3、6、12、24、48 h测定产气量,于24、48 h测定p H、干物质降解率、NH₃-N和VFA。结果表明,各处理组的产气量显著高于对照组（P＜0.05）;各组p H随着时间增长呈下降趋势;干物质降解率随着时间的增长逐渐增加,处理3组的干物质降解率在24 h时显著高于对照组（P＜0.05）;各处理组NH₃-N浓度随着屎肠球菌活菌数的降低而增加,在24 h时,处理3组的NH₃-N浓度显著高于对照组（P＜0.05）;添加屎肠球菌显著提高乙酸、丙酸、和TVFA浓度（P＜0.05）。本试验建议屎肠球菌在绵羊中的最适添加量为1×10¹⁰ CFU/m L。试验二:不同益生菌对绵羊生产性能和营养物质消化率的影响本试验选取24只体重为（32.7±4.7）kg、安装瘘管的成年绵羊。随机分为4组,每组6个重复,分别为CK组（添加10 m L发酵液）、S组(添加10 m L 1×10¹⁰ CFU/m L屎肠球菌发酵液)、K组(添加10 m L 1×10¹⁰ CFU/m L枯草芽孢杆菌发酵液)和F组(添加5 m L 1×10¹⁰CFU/m L屎肠球菌发酵液+5 m L 1×10¹⁰ CFU/m L枯草芽孢杆菌发酵液)。于每期第5～12 d进行消化试验并测定营养物质消化率,于正饲期每期第30 d对试验动物的称重并计算F/G。结果表明:Ⅰ期时,S组和K组的ADG高于CK组（P＞0.05）,F组F/G为最高,K组和F组的EE消化率显著低于CK组（P＜0.05）;Ⅱ期,K组的ADG高于CK组（P＞0.05）,S组F/G为最高,S组ADF消化率显著高于CK组（P＜0.05）。综上,添加60 d屎肠球菌更利于绵羊对营养物质的消化。试验三:不同益生菌对绵羊瘤胃发酵参数的影响试验动物及分组同试验二。于每期第1～3 d连续采集0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的瘤胃液,进行p H、NH₃-N和VFA的测定。结果表明:Ⅰ期时,各处理组p H、NH₃-N和VFA含量与CK组相比无显著差异（P＞0.05）;Ⅱ期时,K组乙酸显著低于S组和F组（P＜0.05）,但与CK组差异不显著（P＞0.05）,K组丙酸显著低于CK组和S组（P＜0.05）,K组的TVFA浓度显著低于其他各组（P＜0.05）,F组的乙丙比显著高于其他各组（P＜0.05）。综上,从瘤胃发酵指标分析复合益生菌剂优于屎肠球菌和枯草芽孢杆菌添加效果。试验四:不同益生菌对绵羊瘤胃微生物区系的影响试验动物及分组同试验二。于每期第30 d晨饲前0～1 h内采集瘤胃液,进行原虫计数和16S r DNA测序。结果表明:各处理组原虫数量与CK相比无显著差异（P＞0.05）。Ⅰ期时,各处理组优势菌门及菌属相对丰度与CK组相比差异不显著（P＞0.05）;Ⅱ期时,S组的未分类菌属-F082相对丰度显著低于CK组（P＜0.05）,K组和F组的疣微菌门相对丰度显著低于CK组（P＜0.05）。综上,添加60 d屎肠球菌和枯草芽孢杆菌及其复合菌剂会影响绵羊瘤胃微生物某些菌门或菌属的相对丰度。试验五:不同益生菌对绵羊血清免疫指标的影响试验动物及分组同试验二。于正饲期第0、15、30、45和60 d采血用于血清免疫指标的测定。结果表明:0 d时,S组和K组的IL-2、TNF-α以及F组的Ig A含量均显著高于其他各组（P＜0.05）,CK组的Ig G含量显著低于其他各组（P＜0.05）;15 d时,F组的IL-2显著高于CK组（P＜0.05）,CK组的IL-6显著高于S组和K组（P＜0.05）,S组Ig A、Ig G、Ig M和TNF-α以及K组的TNF-α均显著高于其他各组（P＜0.05）;30 d时,CK组的IL-2、S组的Ig A以及F组的IL-2和Ig M均显著高于其他各组（P＜0.05）,S组和K组的IL-6显著低于CK组（P＜0.05）;45 d时,S组的IL-2、CK组的IL-6和Ig A以及F组的IL-2、Ig A和Ig M均显著高于其他各组（P＜0.05）,CK组的TNF-α显著高于K组和F组（P＜0.05）;60 d时,CK组的IL-2和IL-6、S组的Ig A、Ig M、TNF-α以及F组的Ig M均显著高于其他各组（P＜0.05）。综上,添加屎肠球菌和枯草芽孢杆菌可以提高绵羊免疫球蛋白和细胞因子浓度,单一菌剂的添加效果优于复合益生菌剂的添加效果。结论:添加屎肠球菌可以促进绵羊营养物质消化,改善绵羊免疫指标并对绵羊瘤胃微生物区系的纤维菌门或菌属具有调节作用,添加复合菌剂可以影响瘤胃发酵类型,添加60 d屎肠球菌的效果较好。