牛传染性鼻气管炎病毒gB和gE基因蛋白原核表达及其间接ELISA检测方法的建立
牛传染性鼻气管炎会影响牛群的正常生长,一定程度上阻碍了养牛业的蓬勃发展,也对我国动物和动物产品的国际贸易带来不利的影响。我国的牛传染鼻气管炎的检测标准推荐的血清学方法是病毒中和试验和ELISA方法。病毒中和试验耗时耗力,不适用于流行病学调查,且我国暂且没有IBR的ELISA商品试剂盒。虽然在国外有许多国家已经研制成功,但是价格昂贵,不适用于我国的临床应用。因此研制出成功的ELISA试剂盒就显得极其重要。本论文对牛传染性鼻气管炎gB、gE主要抗原区域进行原核表达及用纯化的重组蛋白建立间接ELISA检测方法,为研制面向社会需求、具有良好应用前景的IBR诊断方法提供辅助性技术手段,并且gE-ELISA方法的建立,可用于区分自然感染和野毒株感染。研究取得结果如下:成功克隆出牛传染性鼻气管病毒的gB（312～529 aa,661 bp）和gE基因（188～420 aa,667 bp）的表达片段,构建重组原核表达质粒p ET-32a-gB和p ET-28a-gE,且两种蛋白的表达形式都是包涵体,经镍柱亲和层析纯化得到分别为60 ku的gB蛋白和30 ku的gE蛋白,Western blot分析,两种重组蛋白能够与IBRV阳性血清特异性结合,证明有一定的生物学活性。建立的IBRV gB间接ELISA最佳包被量为8μg,用5%脱脂牛奶封闭,待检血清以1:200稀释,酶标二抗以1:2 500稀释,作用时间均为1 h,TMB显色时间为15 min,S/P≥0.396判定为阳性。与IDvet公司的IBR gB-ELISA商品化试剂盒进行比较,阳性符合率为86.5%,并且特异性较强,灵敏度较高,重复性较好。建立的IBRV gE间接ELISA最佳包被量为5μg,用5%脱脂牛奶封闭,待检血清以1:25稀释,酶标二抗以1:2 500稀用时间均为1 h,TMB显色时间为15 min,S/P≥0.373判定为阳性。与IDvet公司的IBR gE-ELISA商品化试剂盒进行比较,阳性符合率为92%,并且特异性较强,灵敏度较高,重复性较好。
- 作者：
- 郭良帅
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2022年
- 导师姓名：
- 焦海宏；吴发兴
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 牛传染性鼻气管炎病毒；gB糖蛋白；gE糖蛋白；间接ELISA
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- 基金项目：
- 2021年度农业农村部项目“优先防治动物疫病流行病学调查和防治措施评估”（项目编号:16210184）课题主持人:马洪超 研究员（中国动物卫生与流行病学中心）