国内部分地区奶牛乳腺炎源肺炎克雷伯菌生物学特性研究

奶牛乳腺炎是由病原菌侵入和饲养管理等多种因素引起的奶牛乳腺组织疾病,常导致奶牛产乳能力及乳汁质量下降。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,Kp）作为导致奶牛乳腺炎的重要病原菌之一,是普遍存在于环境中的条件性人兽共患致病菌,近年来由Kp感染导致的奶牛乳腺炎发病率呈上升趋势,严重制约奶牛养殖业的健康发展。因此,对奶牛乳腺炎源肺炎克雷伯菌进行流行病学调查及生物学特性分析,对该病防控具有重要意义。为了解奶牛乳腺炎源Kp分离株的分子流行特征,本研究2021年自全国部分地区患有乳腺炎奶样中分离鉴定了131株Kp,开展如下研究:1.奶牛乳腺炎源肺炎克雷伯菌的流行病学调查从我国部分省市规模化奶牛养殖场收集患乳腺炎奶牛的495份奶样,分离到131株肺炎克雷伯菌,通过拉丝试验鉴别出19株高毒力株;采用PCR方法从分离株中检测出12种毒力基因（mrk A、ent B、wab G、fim H、ecp D、kfu、uge、iro N、wca G、iuc A、iro B、alls）,其中mrk A（93.12%）和ent B（70.22%）检出率最高,分离株不携带rmp A、mag A和ycf基因。药敏试验结果表明,分离株耐药性强且多重耐药,对阿莫西林、氨苄西林的耐药率最高,分别为90.83%（119/131）和89.31%（117/131）;对喹诺酮类（环丙沙星,恩诺沙星）、碳青霉烯类（美罗培南）药物敏感,耐药率仅为1.53%（2/131）、5.34%（7/131）和1.53%（2/131）;所有分离菌对头孢他啶均敏感。对9种β-内酰胺酶耐药基因检测结果表明,分离株中能检测到（TEM,SHV,KPC,Amp C,bla NDM,p OXA-48,bla CTX-M,DHA）8种耐药基因,无VIM基因;其中TEM和SHV检出率最高,分别为70.99%（93/131）和56.48%（74/131）。荚膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）检测结果表明,K57是优势血清型,检出率为45.03%（59/131）;K20和K5血清型较少,分别为4.58%（6/131）和1.52%（2/131）;48.85%（64/131）的分离株不属于上述6种血清型。2.奶牛乳腺炎肺炎克雷伯菌AHL信号分子检测细菌为适应生存环境的变化,利用群体感应（Quorum sensing,QS）协调其微生物群落的基因表达和生理行为。N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）信号分子介导了革兰阴性菌间的QS,参与调控细菌的毒力因子分泌、运动性、胞外酶产生和生物膜的成等,增加细菌群体的稳定性。为鉴别奶牛乳腺炎源肺炎克雷伯菌中是否分泌AHLs信号分子,本研究分别利用根瘤脓杆菌（Agrobacterium tumefacient）NTL4（p ZLR4）和紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026开展AHLs检测的方法,通过对2种AHLs检测方法的特异性比较和检测条件的优化,最终确定利用紫色杆菌CV026检测奶牛乳腺炎源Kp的AHLs信号分子。运用紫色杆菌CV026对本次分离的131株Kp的AHL检测结果表明,本次分离的Kp不产生C4～C8的信号分子。3.肺炎克雷伯菌生物被膜形成及信号分子对其影响探究为了评价肺炎克雷伯菌分离株生物被膜形成（Biofilm formation,BF）能力,通过结晶紫染色法对131株肺炎克雷伯菌BF进行检测,以阴性对照三倍的标准差加平均OD值确定基准（ODc）,本研究Kp的BF参考基准值为0.38,结果表明,131株奶牛乳腺炎源Kp菌株中,38.93%（51/131）的分离株生物被膜形成能力弱(1 OD_C＜OD₅₉₅＜2 OD_C),23.66%（31/131）菌株生物被膜形成能力中等(2 OD_C＜OD₅₉＜4 OD₅₉₅),18.32%（24/131）菌株生物被膜形成能力强(OD₅₉₅＞4 OD_C)。为研究培养温度、培养时间对Kp形成BF的影响,选取3株BF形成能力强的菌株（Kp-3、KP-15、Kp-18）,开展上述条件对其BF形成的影响研究。结果表明,37℃培养24h为Kp形成BF最佳培养条件。为探究AHLs信号分子对Kp形成BF的影响,分别选取生物被膜形成能力强（Kp-3、Kp-15、Kp-18）、中等（Kp-120、Kp-102、Kp-21）、弱（Kp-131、Kp-87、Kp-39）和不形成生物被膜（Kp-130、Kp-41、Kp-59）的Kp分离株,开展信号分子对其BF形成的影响研究。结果表明,外源添加信号分子C6-HSL和3-oxo-C6-HSL能够抑制Kp分离株的BF形成能力（P＜0.05）。结论:国内部分地区乳腺炎源牛奶样品Kp检出率为26.46%,其中高毒力肺炎克雷伯菌占14.5%。分离株普遍携带毒力基因,其中同时携带6种毒力基因的分离株占最高比例,占26.72%;临床株对青霉素类等药物耐药性强且多重耐药性,并携带了多种β-内酰胺类耐药基因。乳腺炎源肺炎克雷伯菌分离株不产生AHLs信号分子,形成生物被膜阳性率高达80.91%,添加C6-HSL和3-oxo-C6-HSL对生物被膜形成有抑制作用,本研究为奶牛乳腺炎源Kp防控提供参考。