miR-155-5p/QKI5在糖尿病小鼠心肌纤维化中的作用

目的:明确mi R-155-5p及RNA结合蛋白QKI5在糖尿病心肌中的表达水平变化,探讨mi R-155-5p/QKI5在糖尿病心肌纤维化中作用,为解析糖尿病心肌病发病机制提供新的理论基础。方法:（1）生物信息学分析:GEO数据库中查找到了糖尿病心衰病人心肌组织样本中micro RNA表达谱数据,下载相关数据并分析mi R-155在糖尿病心衰病人心肌中的表达差异;通过Target Scan7.2、mi RDB在线数据库预测人源和鼠源mi R-155的下游靶点,选取两个数据库的交集靶基因,行GO富集分析（2）体外实验:（1）选取MCFs作为体外实验的细胞器,将细胞进行分组,分别为Vector,Vector+HG,QKI5,QKI5+HG;NC,NC+HG,si QKI5,si QKI5+HG,向MCFs中分别细胞转染过表达质粒载体QKI5（2 ug）和si QKI5（10 n M）,24h后给予高糖（35 m M）,再放入培养箱24 h做后续实验处理。Western blot检测CollagenⅠ,CollagenⅢ,QKI5,α-SMA等相关蛋白水平的变化,q RT-PCR检测转染过表达QKI5后的CollagenⅠ,α-SMA的m RNA水平的变化。（2）如前者一样,将细胞进行分组,为NC,NC+HG,Mimic,Mimic+HG,Inh,Inh+HG,再分别向MCFs进行细胞转染mi R-155-5p mimic和mi R-155-5p inhibitor,24 h后给予高糖,再放入培养箱培养继续24 h,然后留作后续实验。Western blot检测相关蛋白如CollagenⅠ,CollagenⅢ,QKI5,α-SMA等蛋白水平变化。最后Ed U免疫荧光检测质粒过表达QKI5和mi R-155-5p inhibitor对细胞增殖的影响。（3）体内实验:选取小鼠C57BL/6,糖尿病模型组（DM,n=20）高糖高脂饮食4周后,单剂量一次性STZ(100 mg·kg^-1)腹腔注射,随机血糖高于16.7 mg·L^-1确定为糖尿病模型成功,正常对照组（Con,n=10）采用正常饮食,等剂量柠檬酸盐缓冲液腹腔注射,成模10周后,用1%戊巴比妥钠(80 mg·kg^-1)麻醉,开胸取心脏,生理盐水灌注,所取的心脏组织在滤纸上吸水之后,放置于-80℃冰箱,用于后续实验。HE染色和天狼猩红染色观察糖尿病心肌组织病理变化,q RT-PCR检测糖尿病小鼠心肌组织CollagenⅠ,CollagenⅢ,QKI5,α-SMA m RNA表达水平。Western blot检测糖尿病心肌组织中的QKI5的表达水平的变化以及纤维化相关标志物CollagenⅠ,CollagenⅢ,α-SMA的表达水平的变化。结果:（1）生物信息学分析:非编码RNA表达谱（GSE26887）分析显示,在糖尿病心肌病中,心脏mi R-155相较于正常组显著上调。micro RNA靶点预测软件显示mi R-155的下游靶基因交集有195个,发现了QKI5也在下游靶点中,并且因此作为mi R-155的下游靶基因的研究对象。GO富集分析显示了QKI5在生物体内的生物过程。（2）体外实验:（1）在转染进入细胞的过表达QKI5和si QKI5后,与对照组相比,Western blot检测出CollagenⅠ,CollagenⅢ,α-SMA在高糖诱导下都有升高,当有过表达QKI5干预时,CollagenⅠ,CollagenⅢ的表达显著下调,当沉默了QKI5表达时,上述蛋白表达水平均明显上调,而RNA结合蛋白QKI5在高糖干预下,表达大大下降;与高糖组相比,当过表达QKI5和高糖同时存在时,CollagenⅠ表达水平明显下调。q RT-PCR结果表明,在高糖诱导下,CollagenⅠ和α-SMA的m RNA含量都显著增加。（2）在对细胞进行分别瞬时转染mi R-155-5p mimic和mi R-155-5p inhibitor后,与对照组相比,Western blot检测出CollagenⅠ,CollagenⅢ,α-SMA在高糖诱导下表达上升,当有mi R-155-5p mimic转入后,CollagenⅠ,CollagenⅢ,α-SMA蛋白表达直线大幅增加;与高糖组相比,当有mi R-155-5p mimic和高糖同时存在时,CollagenⅠ较高糖组表达更有所提高;而QKI5相对于对照组在mi R-155-5p mimic存在下表达水平则大幅下降,当有mi R-155-5p mimic和高糖同时存在时,则相较于高糖组表达水平下降的更为厉害。在转入mi R-155-5p inhibitor后,CollagenⅠ的表达水平有所下调,而QKI5表达水平上调,CollagenⅢ,α-SMA表达水平则无明显变化。（3）体内实验:HE染色发现糖尿病小鼠心肌组织紊乱排列,天狼猩红染色发现糖尿病小鼠心肌组织胶原较对照组明显增加。q RT-PCR结果表明在糖尿病小鼠心肌组织中CollagenⅠ,CollagenⅢ,mi R-155表达水平显著上升,而QKI5表达水平显著下降。Western blot结果显示,QKI5在糖尿病诱导的心肌中表达严重下调,CollagenⅠ,CollagenⅢ,α-SMA表达都有所升高。结论:来源于GEO26687的mi RNA表达谱数据显示,糖尿病心衰患者左心室组织样本中mi R-155-5p表达要显著高于非糖尿病心衰患者;QKI5的表达减轻高糖诱导MCFs胶原蛋白合成;mi R-155-5p靶向抑制QKI5的表达,从而促进高糖诱导MCFs胶原蛋白合成及表达;mi R-155-5p靶向抑制QKI5的表达,促进高糖诱导MCFs增殖;在糖尿病小鼠纤维化心肌组织中mi R-155-5p表达升高,而QKI5表达下调,这一结论进一步暗示mi R-155-5p/QKI5可能在糖尿病心肌纤维化中的重要调控作用,精确分子调控机制有待后续进一步深入探讨。