荒漠植物花花柴SOS基因的克隆及功能分析
由于地理环境和气候的差异,植物也会面临各种不同的逆境胁迫,其中非生物胁迫是导致植物萎蔫以及死亡的重要原因之一。非生物胁迫导致的植株损失达6%～20%,其中盐碱地是生态系统的一部分,全球盐碱化土壤占陆地面积5%。盐碱地其特有的物理、生物学特性往往会导致生态系统物质、能量的异常循环,从而导致了生态资源的浪费,生态环境脆弱,并带来了严重的经济损失和次生灾害。盐过度敏感（SOS）胁迫信号途径与离子稳态及耐盐能力有关。SOS信号通路由三个主要蛋白组成:SOS1、SOS2和SOS3。通过对SOS途径各基因的克隆,本研究为功能基因应用提供基因资源和研究基础。花花柴（Karelinia caspia）是一类广泛分布在我国新疆塔里木盆地范围内的沙漠植物。因为常期生长于沙漠等自然环境中,花花柴有极强的抗旱、耐高温、耐盐等抗逆性,是研究荒漠植物抗逆性的最重要植株资源之一,为棉花等作物提供基因资源。本文旨在克隆花花柴SOS途径的相关基因并分析其基因功能,主要研究结果如下:（1）成功克隆花花柴SOS途径相关基因SOS2和SOS3,并进行了生物信息学分析。SOS2的长度为1404 bp,编码467个氨基酸,将其命名为Kc SOS2。SOS3的长度为651 bp,共含有216个氨基酸,因此将其命名为Kc SOS3。NCBI在线对比结果表明,Kc SOS2和向日葵的SOS2的氨基酸序列的相似度最高,达90.83%;Kc SOS3和向日葵SOS3的氨基酸序列的一致性最高,达90.32%。（2）通过300 mmol/L Na Cl和100 mmol/L Na2CO3的混合溶液、自然干旱6天、45℃高温、4℃低温和15%PEG渗透胁迫下对花花柴中Kc SOS2、Kc SOS3进行基因的表达模式解析。结果表明:在未处理的花花柴根、茎和叶片上,SOS3表达的表达量比较接近,但在根中表达量要比茎和叶器官高。说明Kc SOS3在花花柴中有组织特异性表达。Kc SOS3基因在盐碱胁迫条件下根、茎中的表达量呈现低-高-低趋势;叶中的表达量呈现下降趋势。根、茎、叶中Kc SOS2的表达量呈现下降。Kc SOS3基因在干旱条件下处理时,根、茎、叶中的表达量均呈现高-低趋势。根、茎、叶中Kc SOS2的表达量均呈现下降。Kc SOS3基因在45℃条件下根中的表达量呈现高-低-高趋势,茎中的表达量呈现低-高-低;叶中的表达量呈现下降趋势。Kc SOS2的表达量茎中的表达量呈现增高趋势;叶中的表达量呈现高-低-高的趋势。Kc SOS3基因在4℃条件下低温处理时,根中的表达量呈现低-高趋势;茎中的表达量呈现下降趋势。Kc SOS2基因在4℃条件下低温处理时,根、茎、叶中Kc SOS2的表达量均呈现下降趋势。Kc SOS3基因在15%PEG渗透处理条件下处理时,根、茎、叶中的表达量均呈现低-高趋势。根、茎、叶中Kc SOS2的表达量呈现下降趋势。（3）成功构建了原核超表达载体p ET-28a-Kc SOS2、p ET-28a-Kc SOS3,进行原核表达分析。利用设计的含有双酶切位点的引物,获得带酶切位点的Kc SOS3、Kc SOS2质粒,与p ET-28a重组后在大肠杆菌DH5α中保存。在大肠杆菌BL21中分别诱导Kc SOS2、Kc SOS3表达,蛋白质条带大小约50k Da、24k Da,表明Kc SOS2、Kc SOS3基因可以进行原核表达。（4）成功构建了真核超表达载体p K2GW7-Kc SOS3、p K2GW7-Kc SOS2,并进行了转基因烟草、棉花、拟南芥的转化。利用基因重组（Gateway）技术将所获得的花花柴基因SOS3、SOS2,构建在p K2GW7植物表达载体上,获得了p K2GW7-Kc SOS3、p K2GW7-Kc SOS2植物表达载体,并将所得载体导入农杆菌GV3101菌株中。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草和棉花下胚轴、蘸花法转化拟南芥,获得了烟草、棉花愈伤组织。本研究克隆了花花柴SOS3、SOS2基因,分析了其在四个非生物胁迫条件和渗透胁迫下的表达模式,构建了原核超表达载体和真核超表达载体,并进行了转基因烟草、棉花、拟南芥的转化,为进一步深入研究花花柴SOS3、SOS2基因的功能奠定了基础,为棉花等作物提供基因资源和研究基础。
- 作者：
- 郭媛
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2022年
- 导师姓名：
- 王彦芹
- 中图分类号：
- Q943.2
- 关键词：
- 荒漠植物；花花柴；非生物胁迫；SOS基因
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- 基金项目：
- 兵团财政科技计划项目“强南”科技创新骨干人才“沙漠植物花花柴耐高温相关基因的克隆及转化棉花的研究”的部分研究成果（项目编号:2021CB013）课题主持人:王彦芹教授（塔里木大学）%国家自然科学基金项目“沙漠植物花花柴花器官耐高温的生物学功能”的部分研究成果（项目编号:31660085）课题主持人:王彦芹教授（塔里木大学）