柔嫩艾美耳球虫果糖1，6-二磷酸醛缩酶1的生化特性及抑制剂抗球虫活性的初步研究

鸡球虫病是一种危害严重养禽业的寄生性原虫病,近年来随着抗球虫病药物的大规模使用,鸡球虫抗药性越来越严重,导致原有抗球虫病药物的治疗效果严重下降,因此生产实际中缺乏治疗效果出色的抗球虫药物,目前急需新型的抗球虫药物面世。前期研究显示,鸡球虫入侵阶段主要依靠糖酵解为虫体提供能量。醛缩酶（Aldolase,ALD）是糖酵解的主要代谢酶,研究发现,顶复门原虫的醛缩酶参与顶复门原虫的能量代谢,而且其非酶活性可能参与虫体粘附及入侵宿主细胞等过程,并且与宿主醛缩酶存在差异,推测醛缩酶可能成为抗原虫药物研发的潜在药物靶标。鉴于此,本研究以柔嫩艾美耳球虫为研究对象,克隆了Etald1基因,并对EtALD1进行原核表达及重组蛋白的纯化与鉴定,分析柔嫩艾美耳球虫四个发育阶段的Etald1基因转录水平,并对子孢子亚细胞定位分析,初步分析其酶动力学及抑制动力学特性,并通过酶抑制动力学筛选抑制剂,利用动物试验初步分析抑制剂的抗球虫活性。对Etald1基因的克隆、表达及不同发育阶段基因转录水平与亚细胞定位进行分析。根据基因组数据库中预测的Etald1基因序列设计特异性引物,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA为模板,反转录为cDNA后用PCR方法扩增Etald1基因序列,利用软件对Etald1基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,Etald1基因的开放阅读框（ORF）为1077 bp,编码358个氨基酸;该蛋白理论分子量大小为39.99 kD,理论等电点（PI）为5.0;将EtALD1与不同物种ALD氨基酸序列进行比对,发现顶复门原虫ALD具有保守的酶活性位点。选用pCold Ⅰ作为原核表达载体,将测序正确的阳性克隆质粒与表达载体分别进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,构建原核表达重组质粒pCold Ⅰ-EtALD1,将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株,在0.1 mM IPTG,16℃条件下诱导16 h。SDS-PAGE凝胶电泳检测rEtALD1为部分可溶性蛋白。利用Ni柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,得到较高纯度的rEtALD1蛋白,经Western-blot鉴定为目的蛋白。Etald1基因在柔嫩艾美耳球虫的未孢子化卵囊阶段转录水平最高。通过亚细胞定位分析得知EtALD1均匀的分布于子孢子的胞质中。对EtALD1的酶动力学及酶抑制动力学进行分析。将纯化的rEtALD1进行酶活性测定,同时分析pH及温度对酶活性的影响,并进行了酶动力学及抑制动力学试验。结果显示,EtALD1最佳酶活性反应条件为:pH 7.5,温度28℃。EtALD1对 NADH 的Km值为 213.02±8.54 μM,Vmax值为 11.94 μmol/min/μg;对 F16BP的Km值为49.85 ±3.30 μM,Vmax值为3.69 μmol/min/μg。酶抑制动力学分析发现,（R）-（-）-联萘酚膦酸酯、1,1’-联萘-2,2'-二基磷酸氢盐和1-萘磷酸单钠盐对EtALD1具有一定的抑制作用,其IC50值分别为2.40±0.23 μM、6.17±0.67 μM和101.93 ± 8.31μM。对EtALD1酶抑制剂的抗球虫活性进行了初步的研究。利用动物试验,初步评价酶抑制动力学筛选获得的（R）-（-）-联萘酚膦酸酯、1,1'-联萘-2,2'-二基磷酸氢盐和1-萘磷酸单钠盐等三种化合物的抗球虫活性。结果发现,（R）-（-）-联萘酚膦酸酯0.5 mg/kg、1 mg/kg及1,1’-联萘-2,2'-二基磷酸氢盐1 mg/kg剂量组具有中效抗球虫效果,ACI 值分别为 162.0、163.23 及 164.14。1,1’-联萘-2,2'-二基磷酸氢盐 0.5 mg/kg及1-萘磷酸单钠盐25 mg/kg、50 mg/kg剂量组具有低效抗球虫效果,ACI分别为140.16、136.16 及 157.18。本研究首次成功地克隆了Etald1基因,构建重组表达质粒pCold Ⅰ-EtALD1并进行了重组表达;发现Etald1在柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊中的转录水平最高;亚细胞定位分析得出EtALD1均匀分布于子孢子胞质中;酶动力学分析表明,EtALD1可催化底物果糖1,6-二磷酸;酶抑制动力学分析发现（R）-（-）-联萘酚膦酸酯、1,1-联萘-2,2-二基磷酸氢盐和1-萘磷酸单钠盐均具有一定的抑制活性;动物试验表明,（R）-（-）-联萘酚膦酸酯（1 mg/kg和0.5 mg/kg）及1,1'-联萘-2,2'-二基磷酸氢盐（1 mg/kg）具有中效抗球虫效果,其ACI值均达到160以上。1,1'-联萘-2,2'-二基磷酸氢盐（0.5 mg/kg）及1-萘磷酸单钠盐（25 mg/kg和50 mg/kg）具有低效抗球虫效果,ACI值达130以上。该研究将为抗柔嫩艾美耳球虫药物的研发奠定良好的基础。