高粱成熟种子转基因体系构建
高粱是重要的旱粮作物在世界各地均有种植。早期大部分高粱被用作粮食、酿酒和燃料乙醇的生产,随着人们生活水平的提高,高粱的栽培目的也发生着变化。目前高粱多用于饲料。但高粱育种面临远缘杂交不亲和、耗时长等问题。与其他作物如玉米、小麦、水稻等相比,由于较难建立其高效的组织培养和转化体系,因此在遗传转化方面的研究工作发展较为缓慢。高粱早期的研究主要以建立组织培养和转基因体系为重点,但还未取得显著的研究进展。目前国内外以幼胚为外植体进行高粱遗传转化的研究工作最成功,但幼胚取材受时间、地域限制,不能保证外植体供应,且幼胚接种时操作费力、费时。以成熟种子为外植体进行组织培养比幼胚更加便于操作,且取材方便,能够保证充足的外植体供应。因此,建立高粱成熟种子的转基因体系对高粱育种具有重要意义。本试验从愈伤诱导的120个品系中筛选出一个品系32进行高粱组织培养和转基因体系的构建。愈伤诱导培养时,将成熟种子接到5种不同CuSO4浓度的诱导培养基中,试验结果表明,当CuSO4浓度为9.5 μM时愈伤诱导率最高为58.58%;继代培养时,将去芽的愈伤接到2,4-D浓度为2 mg/L和5 mg/L的继代培养基中,继代14 d后统计胚性愈伤率,试验结果表明,2,4-D浓度为2 mg/L时胚性愈伤率最高为56.47%;分化培养时,将继代14 d的愈伤接到IAA和6-BA不同浓度配比的分化培养基中,试验结果表明,IAA和6-BA浓度均为1 mg/L时愈伤的分化率最高为35.59%;将继代14 d的愈伤接到4种不同KT浓度的分化培养基中,试验结果表明,KT浓度对愈伤的分化率影响不显著;将继代14 d的愈伤接到4种不同TDZ浓度的分化培养基中,试验结果表明,当TDZ浓度为0.5 mg/L时分化率最高为61.11%;将不继代、继代7 d和继代14 d的愈伤接到分化培养基上研究继代时间对愈伤分化率的影响,试验结果表明,当继代时间在一周之内时分化效率最佳为67.78%。将构建好的组织培养体系用于高粱转基因体系的构建及轰击参数的优化:一组愈伤组织用1305-GFP质粒进行基因枪轰击;另一组愈伤组织用1305-GFP和1305-NPTII两种质粒同时进行基因枪轰击;把轰击后的愈伤接到含30 mg/L G418的分化培养基上培养,试验结果表明,只导入1305-GFP的愈伤组织经含有30mg/LG418的分化培养基筛选后愈伤组织逐渐褐化,最终死亡;而同时导入1305-GFP和1305-NPTII的愈伤经筛选培养后愈伤组织紧实,呈淡黄色并逐渐分化成苗。将1305-GUS质粒用直径0.6μm和1 μm的金粉包裹后分别用三种不同轰击压强和距离的参数组合对愈伤进行轰击,轰击后培养3 d用GUS染色剂检测愈伤,试验结果表明,当轰击参数为金粉直径0.6 μm,轰击距离12 cm,压强1100 psi时,基因枪轰击效果最佳为92.59%。高粱成熟种子转基因体系初步建立。对转入GFP和NPTII基因的T0植株进行PCR检测和荧光显微镜下压片观察,结果表明,GFP和NPTII基因被成功转入再生植株中,且能在转基因植株中正常表达。对T1代进行PCR检测和荧光显微镜下压片观察,结果表明,T1中73.79%的植株同时遗传了GFP和NPTII基因,转入的基因能在后代中稳定遗传。本试验为高粱的遗传育种奠定了良好基础。
- 作者：
- 高丽
- 学位授予单位：
- 安徽科技学院
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 李杰勤；徐智明
- 中图分类号：
- S514
- 关键词：
- 高粱；组织培养；转基因
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- 基金项目：
- 国家自然科学基金（项目编号:31671753）%安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目（项目编号:gxyqZD2016-217）%安徽省草学重点学科（项目编号:皖教科秘[2014]28）