发芽苦荞谷氨酸脱羧酶及琥珀酸半醛脱氢酶酶学特性的研究
苦荞（Fagopurum Tartaricum（L.）Gaertn）学名鞑靼荞麦,含有丰富的营养物质,尤其含有较多的芦丁、槲皮素、桑色素、莰菲醇等酚类物质,有软化血管,改善微循环,清热解毒、活血化瘀、降血糖、降血脂,加强胰岛素,改善微循环等作用。苦荞中含蛋白酶抑制剂等抗营养因子,通过发芽可以使抗营养因子消失或降解,还可以起到富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）等功能性物质的作用,谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15）是 GABA 合成的限速酶,琥珀酸半醛脱氢酶（succinic semialdehyde dehydrogenase,SSADH,EC 1.2.1.16）是GABA代谢支路最后一步的反应酶,催化琥珀酸半醛不可逆的转化为琥珀酸。研究GAD和SSADH的酶学特性,可为苦荞中GABA的生物富集提供理论依据。本文利用响应面法优化了发芽苦荞SSADH酶活测定的最佳条件;研究了发芽苦荞GAD和SSADH的酶学特性。主要研究成果如下:1、利用40%～60%的（NH4）2SO4对发芽苦荞GAD提取液进行分级沉淀,沉淀后的发芽苦荞GAD纯化倍数可达4.30倍,GAD的比活力达到了 2.02 U/mg,酶活回收率为78.36%。发芽苦荞GAD最适反应温度为40℃,在30～50℃时,热稳定性较高,最适反应pH为5.7,发芽苦荞GAD在pH 5.0～8.0时,可以保持较高的活力。Cu2+和Mg2+对发芽苦荞GAD活性没有太大影响,两者间差异不显著（P>0.05）。K+、Na+和SDS处理会显著降低GAD活力（P<0.05）,三者处理间差异不显著（P>0.05）;发芽苦荞GAD对底物L-Glu的米氏常数Km和Vmax分别为 0.0197 mol/L,3.34 μg/min。2、采用饱和度为50%～80%的（NH4）2SO4对发芽苦荞SSADH提取液进行分级沉淀,（NH4）2SO4分级沉淀后发芽苦荞SSADH纯化倍数为3.18倍,SSADH的比活力达到了 84.33×103 U/mg,酶活回收率为63.76%;在单因素试验基础上,利用响应面法探讨了 SSADH酶活测定温度、pH和SSA浓度对发芽苦荞SSADH酶活的影响,结果表明:温度和SSA浓度对发芽苦荞SSADH酶活有极显著影响,pH对SSADH酶活影响显著,温度和pH的交互项作用显著（P<0.05）;发芽苦荞SSADH酶活测定最佳条件为:温度30.8℃、pH 8.7、SSA浓度0.3 mmol/L,在此条件下实测发芽苦荞SSADH酶活为346±9.61 nmol/min。方差分析和验证试验均显示,模型的总决定系数为0.9892（P<0.001）,说明模型极显著,校正系数R2adj=0.9752,说明该模型能解释97.52%响应值的变化,可准确预测发芽苦荞SSADH的酶活。3、发芽苦荞SSADH的最适反应温度为30.8℃,最适反应pH为8.7;发芽苦荞SSADH在25℃下的热稳定性最好,酶半衰期为180.00min,优于30℃的64.44 min 和 35℃的 25.56min。发芽苦荞 SSADH 在 pH 7.6、pH 8.1、pH 8.6 时,稳定性大致相同,半衰期分别为34.19min、32.72min、35.83min;在pH9.1时,其稳定性较差,半衰期为23.04min。Cu2+、Co2+、Ni2+对发芽苦荞SSADH酶活力有激活作用,其中Cu2+影响最大（P<0.05）,是对照组的1.21倍;Zn2+、Mn2+、Na+对发芽苦荞SSADH酶活力有抑制作用,其中Zn2+抑制作用最大（P<0.05）;Mg2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+对发芽苦荞SSADH酶活力没有显著影响,相互间差异不显著（P>0.05）。发芽苦荞SSADH对底物SSA的Km值为0.24 mmol/L,Vmax为583.24 nmol/min;对辅酶 NAD+的 Km 值为 0.64 mmol/L,Vmax 为 454.55nmol/min。
- 作者：
- 刘加上
- 学位授予单位：
- 安徽科技学院
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2019年
- 导师姓名：
- 郭元新；刘媛
- 中图分类号：
- S517
- 关键词：
- 发芽苦荞；γ-氨基丁酸；谷氨酸脱羧酶；琥珀酸半醛脱氢酶；酶学特性；响应面法
-
- 基金项目：
- 安徽省自然科学基金项目（项目编号:1808085MC72）