远志多糖的制备、结构及抗肿瘤活性的研究
远志作为一种药食同源的天然物质具有多糖类、皂苷类等活性成分,这些活性成分使远志具有显著的生物活性如抗肿瘤、抗氧化等。研究表明,温度对多糖具有较大的影响,因此本课题在4℃条件下对远志多糖进行提取,并通过正交实验优化多糖的提取工艺,进而对所浸提的多糖进行结构和活性方面的鉴定。本课题以远志的干燥根作为实验原料,在4℃的条件下浸提远志多糖。根据正交实验优化结果,确定了远志多糖的最佳提取工艺:液固比是25:1（mL/g）;浸提时间是7 h;提取次数是3次。将提取的粗多糖用Sevag法除蛋白后,经过100 kDa的透析袋逆向流水透析及Sephadex G-200层析柱分离纯化得到远志多糖（PTP）。此外,对PTP进行成分含量的测定,结果表明PTP中总糖含量、蛋白质和糖醛酸的含量分别为92.32±1.23%、0.31±0.05%、0.42±0.13%。随后对PTP的结构特征进行表征。HPLC法测得PTP中含有单一的多糖组分,且分子量为1.50×106Da。通过HPAEC-PAD检测出PTP主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成,且摩尔比为2.6:1.8:1.0,此外,还含有少量的木糖和甘露糖。与此同时,结合FT-IR、NMR及HPAEC-PAD的检测结果,推测出PTP主要由α-阿拉伯糖,α-葡萄糖和β-半乳糖组成。本课题研究了 FAS/FAS-L途径介导的细胞凋亡。通过检测细胞的抑制作用、形态变化、凋亡情况及蛋白表达等评价了 PTP诱导SPC-A-1细胞的凋亡机制。MTT法表明在用PTP处理细胞时,其细胞的IC 50值在不同时间对应不同的PTP浓度:24 h是 384.52μg/mL;48 h 是 203.12μg/mL;72 h 是 110.51μg/mL。通过 SEM、倒置显微镜及激光共聚焦显微镜发现SPC-A-1细胞出现典型的凋亡特征如细胞皱缩、核固缩、贴壁能力减弱、细胞膜通透性增强以及产生凋亡小体等。通过流式细胞术对SPC-A-1细胞进行凋亡细胞比例、细胞内活性氧水平及细胞周期的鉴定,可以直观地看出细胞内处于凋亡时期的细胞数量增加、细胞内活性氧水平显著上升以及SPC-A-1细胞周期被阻滞在G2/M期。通过免疫印迹法检测SPC-A-1细胞内的相关凋亡蛋白,结果表明 FAS、FAS-L、FADD、Cleaved-Caspase-8 及 Cleaved-Caspase-3 蛋白均有上调趋势。综上所述,PTP可以通过FAS/FAS-L途径诱导SPC-A-1细胞发生凋亡,且呈现出剂量依赖性。
- 作者：
- 余莎莎
- 学位授予单位：
- 天津科技大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2020年
- 导师姓名：
- 刘安军
- 中图分类号：
- TS201.2
- 关键词：
- 远志多糖；结构特征；抗肿瘤活性；死亡受体通路
-