百合抗尖孢镰刀菌细胞突变系的筛选及抗病机制的研究

由尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp. lilii)引起的百合枯萎病是百合切花种植和种球繁育过程中经常发生的病害之一。目前培育并合理利用抗尖孢镰刀菌百合枯萎病的新优品种是防治该病最经济有效的方法之一。百合由于育种周期长，抗病品种选育进展迟缓。利用细胞无性系变异同时将病原菌毒素加入培养基中筛选抗病性种质是选育抗病品种的有效手段之一，但在花卉上的应用较少，而对其抗病机制的深入研究也鲜见报道。本研究通过培养百合细胞无性系并进行尖孢镰刀菌百合专化型粗毒素加压筛选获得了东方百合品种‘卡萨布兰卡’(‘Casa Blanca’)的抗病无性系，为进一步探索其抗病机制，以正常生长的‘卡萨布兰卡’组培苗即感病无性系为对照，从组织细胞学水平、生理生化水平及分子水平上探讨其抗病机制。主要研究结果如下： (1)通过幼苗浸渍法和愈伤组织浸渍法测定尖孢镰刀菌百合专化型毒素的活力，发现无论是在细胞组织水平，还是在植株整体的水平，尖孢镰刀菌毒素对百合都有致毒作用，且随着处理时间的延长，毒害愈发加重，说明利用镰刀菌毒素筛选抗病无性系是可行的。本研究采取一步筛选法，将诱导出的百合胚性愈伤组织培养在含有临界致死浓度的尖孢镰刀菌毒素粗提液培养基上，经过反复筛选，最终得到了抗尖孢镰刀菌枯萎病的突变株系。 (2)通过透射电镜观察百合抗病无性系和感病无性系接种尖孢镰刀菌前后的根部结构，发现在接种前，抗病无性系中有更多的淀粉粒，而在感病无性系中的淀粉粒较少，抗病无性系根部组织细胞中的淀粉粒是感病无性系的2倍。推测淀粉粒可能贮藏了能量，对抗病性起到十分重要的作用。在接种之后，在感病无性系细胞中有菌丝、小型分生孢子、大型分生孢子，且孢子数量明显比抗病无性系中的多。抗病无性系组织细胞中产生大量的降解物，使其具备了阻碍尖孢镰刀菌进一步扩展的能力。 (3)利用紫外分光光度计分析抗病无性系和感病无性系经尖孢镰刀菌及毒素诱导后体内过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等抗病防御酶活性的变化趋势。发现经尖孢镰刀菌及毒素诱导后，抗病无性系和感病无性系体内的POD、PPO、PAL及几丁质酶的活性都表现出先升高后降低的变化趋势，而β-1，3-葡聚糖酶则表现逐渐升高的变化趋势。抗病无性系比感病无性系的POD、PPO、PAL、几丁质酶活性均有所提高，抗病无性系的POD、PPO、PAL活性在48h达到最高，与感病无性系比较，抗病无性系经百合尖孢镰刀菌诱导后，POD活性峰值提高了322.03U/(g·min)，PPO活性峰值提高了64.00U/(g·min)， PAL活性峰值提高了106.67U/(g·min)；抗病无性系经尖孢镰刀菌毒素诱导后，POD活性峰值提高了244.33U/(g·min)；PPO活性峰值提高了53.20U/(g·min)，PAL活性峰值提高了190.00U/(g·min)。 (4)通过转录组测序百合抗病无性系和感病无性系及尖孢镰刀菌诱导抗病无性系和感病无性系后24h、48h的样品，发现百合抗病无性系与感病无性系的差异表达基因数量为1679，其中表达上调的基因数量为962，表达下调的基因数量为717。差异基因主要参与生物刺激反应、防御反应、水杨酸反应，几丁质分解过程，几丁质结合，过氧化物酶活性。百合抗病无性系在接种尖孢镰刀菌百合专化型后24h、48h的差异表达基因数量分别为433和155，百合感病无性系在接种尖孢镰刀菌百合专化型后24h和48h的差异表达基因数量分别为550和799。百合抗病无性系和感病无性系在接种尖孢镰刀菌百合专化型后48h的差异表达基因数量为4051，其中表达上调的基因数量为2035，表达下调的基因数量为2016。差异基因主要参与几丁质分解过程、细胞壁大分子代谢、ATP合成、细胞葡聚糖代谢和氧化还原酶活性。这些基因可能与百合抗病无性系的抗病反应紧密相关。 (5)建立了一种适宜于百合蛋白质组研究的双向电泳技术方法。采用TCA-丙酮法制备百合蛋白质样品可以获得质量较好的蛋白。在双向电泳中600μg的上样量较好，同时优化了等电聚焦程序中的第一步除盐时间(2h)及第二步的除盐时间(2.5h)，这样可以获得较好的双向电泳图谱。 (6)利用蛋白质双向凝胶电泳技术，对抗病无性系和感病无性系及百合尖孢镰刀菌诱导后24h、48h、72h的抗病无性系和感病无性系进行差异蛋白分析。成功鉴定了25个差异蛋白质点，其中10个蛋白质点鉴定为未知功能的蛋白，其功能有待于下一步的深入研究，其余15个蛋白质点依据其相关功能分为4类，即防御反应相关蛋白、光合作用相关蛋白、糖类代谢及能量代谢相关蛋白、热激蛋白。其中参与防御反应的病程相关蛋白(推定的抗病蛋白RPS2、推定的抗晚疫病同族蛋白R1C-3、过氧化物酶Q、抗坏血酸过氧化物酶和NBS-LRR类似蛋白)可能是百合抗病无性系介入抗病防御反应的关键蛋白。 (7)以百合抗病无性系和感病无性系及百合尖孢镰刀菌诱导抗病无性系和感病无性系后48h分别取样进行iTRAQ分析，发现百合抗病无性系和感病无性系的差异蛋白有316个，其中表现上调的有166个，表现下调的有150个。差异蛋白极显著富集的GO-term主要涉及：抗氧化活性、过氧化物酶活性、氧化还原酶活性、转氨酶活性、应激反应。百合感病无性系与接种百合尖孢镰刀菌48h后的差异蛋白有579个，其中上调表达458个，下调表达121个。百合抗病无性系与接种百合尖孢镰刀菌48h后的差异蛋白有108个，其中表现上调的有92个，表现下调的有16个。百合抗病无性系和感病无性系接种尖孢镰刀菌48h后的差异蛋白有1052个，其中表现上调的有579个，表现下调的有473个。差异蛋白极显著富集的Pathway涉及光合生物中的固氮作用、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等，这些蛋白也可能是百合抗病无性系介入抗病防御反应的重要蛋白。 关键词：百合，尖孢镰刀菌百合专化型，毒素，细胞无性系，抗病机制