Notch1信号通路抑制剂对紫杉醇诱导HeLa细胞获得性耐药的逆转及其机制研究

癌症的典型特征为细胞的异常增殖，同时伴有细胞侵袭人体的其它组织或器官。目前癌症治疗的难点之一是癌细胞的耐药性，通常在癌症治疗前划，癌细胞会对药物治疗产生应答，而在治疗的中后期，癌细胞会逐渐表现出耐药性特征，随着这类具有耐药性的癌细胞的增殖，药物治疗的效果降低，癌症最终会复发。癌细胞产生耐药性的机制之一，是在药物诱导、处理时，癌细胞会发生上皮细胞-间充质干细胞转化(EMT)，癌细胞在这一过程被赋予了干细胞的特性——凋亡抵抗、耐药性、增殖率减弱、自我更新、迁移率高。多种信号通路及细胞外因素能够诱导癌细胞的EMT过程，如 Wnt、Notch、TGF-β、EGF等信号通路，以及缺氧、外界环境压力、化学治疗、放射治疗等细胞外因素，这些均是能够诱导癌细胞通过EMT转化为问充质干细胞的因素。目前，常规的癌症治疗方法与EMT通路抑制剂联用是癌症治疗研究领域的一个热点。本论文采用紫杉醇联合Notch信号通路抑制剂(小分子抑制剂DAPT)处理癌细胞株，以期筛选到对药物联用产生显著应答的细胞株，并进一步研究其耐药性的机制。研究内容和结果如下： 1.对10株癌细胞进行药物处理(紫杉醇、或紫杉醇与DAPT联用)，获得了2株对药物联用(紫杉醇和DAPT联用)具有显著应答的细胞株。对紫杉醇诱导HeLa细胞的耐药性进行研究。紫杉醇对HeLa细胞的IC50值约为60 nM，表明未经诱导的HeLa细胞即可具有对紫杉醇的天然耐药性。80天内，用紫杉醇(初始浓度为10 nM，最终增加至420 nM)处理HeLa细胞，可获得耐受高浓度紫杉醇(420 nM)的耐药性细胞。表明紫杉醇能够诱导HeLa细胞产生耐药性。紫杉醇短期(2天，浓度20 nM)和长划处理(80天，浓度增至420 nM)后，HeLa细胞中EMT相关转录因子(SNAIL和/或ZEB1)的蛋白表达水平具有增高趋势和显著增高的现象，表明EMT是紫杉醇诱导HeLa细胞产生耐药性的机制之一。而DAPT能够抑制EMT相关转录因子(SNAIL和ZEB1)的表达，NOTCH1基因沉默也能够显著抑制EMT相关转录因子(SNAIL和ZEB1)的表达。表明DAPT或NOTCH1基因沉默能够抑制紫杉醇诱导的HeLa细胞的EMT过程。紫杉醇与DAPT(或NOTCH1基因沉默、或EGCG)联用处理HeLa细胞，均能显著降低紫杉醇诱导的HeLa细胞耐药性，这些结果进一步表明EMT是紫杉醇诱导HeLa细胞产生耐药性的机制之一。此外，与紫杉醇处理HeLa细胞的效果棚比，药物联用(紫杉醇与DAPT)在细胞周期实验(被阻滞在G2/M期的细胞比率从约33％增至约70％)、生长因子保护力实验(显著抑制生长因子对HeLa细胞提供的保护力)、CD133利CD44的表达水平(显著降低CD133和CD44的表达水平)以及集落形成实验(细胞存活率从10％降至1.6％)中，均具有更优的表现。 2.通过总mRNA提取、反转录、及PCR，荻得了HeLa 细胞NOTCH1受体的负调节区域基因(hNRRl)。成功获得原核重组分泌表达质粒(pBR-hNRRl)和重组表达菌株(W3110/pBR-hNRRl)。重组菌株在诱导培养基能够表达rhNRRl目的蛋白，rhNRRl可经4步得到纯化，纯度约为94％，煤升细菌培养物中最终获得0.47毫克目的蛋白。rhNRR1蛋白含有S1酶切位点可被rhFURIN识别和酶切。rhNRR1蛋白的N末端5个氨基酸测序结果为EEACE，与NRRl理沦蛋白序列的N末端序列一致。这些结果证明rhNRRl蛋白可以在大肠杆菌中分泌表达，并得到纯化。利用纯化的rhNRRl蛋白免疫Balb/C小鼠，可获得针对rhNRRl的多克隆血清，该抗血清能够显著降低HeLa细胞中NOTCH1 ICD的水平，表明多克隆抗血清能够抑制HeLa细胞Notch1信号传导。采用杂交瘤技术最终获得了3株杂交瘤细胞株，它们分泌的特异性单克隆抗体(下文中的特异性抗体均指这种具有抑制Notch1信号通路活性的单克隆抗体)均能够显糟抑制HeLa细胞Notch1信号传导，表明抗体能够识别HeLa细胞NOTCH1受体上的NRR结构域，并抑制HeLa细胞Notch1信号传导。 3.与紫杉醇处理效果相比，紫杉醇联合特异性抗体处理HeLa细胞，能够显著抑制紫杉醇诱导HeLa细胞的耐药性。与紫杉醇处理效果相比，紫杉醇与特异性抗体联用能够显著活化HeLa细胞的凋亡通路(BCL-2蛋白的表达水平显著降低，cleaved CASPASE3的表达水平显著升高)、特异性抗体能够降低ALDH 高活性的细胞量(从17％降至9.5％)、紫杉醇与特异性抗体联用能够显著地抑制HeLa细胞的体外成瘤能力。 综上所述，紫杉醇能够诱导HeLa细胞产生耐药性。在此类具有耐药性的HeLa细胞中， EMT相关转录因子的表达水平会显著增高，表明EMT过程是紫杉醇诱导HeLa细胞耐药性的机制之一。NOTCH1基因沉默能够显著抑制EMT相关转录因子的表达，表明Notch1信号通路能够驱动HeLa细胞的EMT过程。因此针对Notch1信号通路的特异性抑制剂(DAPT为NOTCH1-4信号通路的泛抑制剂)的研究与开发就具有现实意义。NOTCH1的NRR蛋白可在大肠杆菌中分泌表达并得到纯化。采用杂交瘤技术最终获得3株能够显著抑制HeLa细胞Notch1信号传导的特异性抗体。与紫杉醇处理HeLa细胞的效果相比，紫杉醇与DAPT(或沉默NOTCH1基因、或EGCG、或特异性抗体)联用，对HeLa细胞具有更好的效果。 关键词：HeLa细胞：耐药性；Notch1信号通路；负调节区域；抑制性抗体