对来源于Klebsiella sp. LX3的蔗糖异构酶PalⅠ的定点突变及枯草芽孢杆菌表达产物发酵转化分析
异麦芽酮糖（α-D-glucosylpyranosyl-1,6-D-fructofranose）生理功能优良,可作为甜味剂广泛应用,且自然界存在极少;用蔗糖异构酶（EC 5.4.99.11）转化蔗糖生产异麦芽酮糖是目前工业生产的主要方法。由于蔗糖异构酶催化蔗糖转化的过程中始终存在副产物单糖,因而对生产不利。本文以来源于Klebsiella sp LX3的蔗糖异构酶PalI为研究对象,通过定点突变和枯草芽孢杆菌异源表达来探索产物中副产物单糖的消除问题。主要研究内容如下:（1）由于主产海藻酮糖型蔗糖异构酶的产物中单糖（葡萄糖,果糖）较低,因此对主产海藻酮糖型蔗糖异构酶MutB和主产异麦芽酮糖型蔗糖异构酶PalI做比较分析。根据蛋白多序列及结构比对,发现其活性位点空间存在差异及RLDRD loop区表面亲疏水性不同,初步设计了S459A,R452A,S459A/R452A,Lyo,del-D和Lyo/del-D六个突变体,构建Escherichia coli BL21（DE3）重组菌进行表达并纯化。突变株与底物蔗糖反应,通过HPLC对产物分析获得相应的产物参数和酶学参数。结果发现突变体S459A,S459A/R452A,Lyo/del-D的异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比、海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄糖峰面积和比值具有较大变化;其异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比分别为3.5,3.4,3.3与野生型相比分别降低50%左右;而海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄糖峰面积和比值分别为40,49,23与野生型相比分别增高了18%,48%和降低了30%。对S459A,S459A/R452A,Lyo/del-D三个突变体做酶的动力学分析,测定Km值、Vmax;Km分别为171.6μmol/L,158.4μmol/L,160.4μmol/L;Vmax为21.3μmol/L/s,10.7μmol/L/s,4.6μmol/L/s。以4%蔗糖为底物反应1 h计算各酶的转化率,其中S459A,S459A/R452A,Lyo/del-D的转化率分别为71%,37%,72%。（2）蔗糖异构酶催化蔗糖转换的副产物为葡萄糖、果糖,其可作为微生物生长的速效碳源,被微生物利用,从而减少反应中的副产物;将蔗糖异构酶构建到pHT43载体导入食品级表达载体枯草芽孢杆菌WB800菌株中,在30℃使用LSP（LB/Sucrose/Phosphate）培养基诱导表达。用HPLC对发酵液中的各种糖组分分析发现,异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比、海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄糖峰面积和比值的变化主要与培养基中蔗糖的浓度和发酵时间决定。在发酵24 h时,异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比小于2,海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄峰面积和比值为92:1。蔗糖最大转化效果为培养基中20%蔗糖在24h转化完全。
- 作者：
- 王兵兵
- 学位授予单位：
- 大连工业大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2019年
- 导师姓名：
- 李蓉
- 中图分类号：
- TS264.9；TS201.3
- 关键词：
- 蔗糖异构酶；异源表达；定点突变；枯草芽孢杆菌；单糖消除
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