丙酸杆菌产维生素B12代谢解析与强化
维生素B12是哺乳动物体内许多生命活动的必需辅酶因子之一。但哺乳动物自身不能合成,需要通过膳食摄取,仅特定微生物能够合成维生素B12。其中费氏丙酸杆菌符合美国FDA的GRAS（Generally recogized as safe）要求,被用于大规模厌氧发酵生产维生素B12,由此生产的维生素B12可直接用于医药及食品行业。随着人们对维生素B12需求的日益增多,利用费氏丙酸杆菌生产维生素B12变得尤为重要。研究表明,费氏丙酸杆菌由特殊的代谢途径介导维生素B12的生物合成,因此,有必要从整体细胞代谢的角度分析其代谢调节关系,然而对费氏丙酸杆菌生产维生素B12发酵过程中代谢物变化规律尚且未知。本文以费氏丙酸杆菌为研究菌株,以维生素B12产量为衡量标准,利用统计学方法对生产维生素B12的发酵培养基进行优化,利用代谢组学技术分析培养基成分对维生素B12生产的影响,利用基因工程手段提高维生素B12产量。主要研究内容及结果如下:首先通过一系列统计学设计方法对生产维生素B12的发酵培养基组分进行优化。根据Plackett-Burman设计实验确定影响维生素B12生成的四种重要成分为葡萄糖、酵母提取物、KH2PO4和甘氨酸;然后通过Box-Behnken设计获得维生素B12生产的优化培养基配方。利用该优化培养基发酵可获得维生素B12 8.32 mg/L,是原始培养基（3.81 mg/L）的2.2倍。接着利用基于液相色谱-质谱联用的代谢组学分析方法,研究利用原始和优化培养基发酵费氏丙酸杆菌不同时期（对数生长期、稳定期和生产期）胞内代谢物差异性,挖掘有利于维生素B12合成的关键代谢物及代谢途径。此法共鉴定出72种胞内代谢物,主成分分析表明代谢物组学法可以区分不同发酵阶段的代谢物。通过正交偏最小二乘判别分析法初步确定对数期46种、稳定期26种和生产期23种标志性代谢物。利用途径富集分析和代谢途径综合分析确定TCA循环、磷酸戊糖途径和氨基酸代谢是对维生素B12生产影响显著的代谢途径。最后,采用基因工程手段分别表达了维生素B12合成途径中内源基因（cobA、cbiK和cobR）、外源基因（RccobA和SmfldA）与多基因（钴离子转运蛋白基因簇）,其中表达钴离子转运蛋白基因簇的菌株维生素B12产量为10.23 mg/L,与对照菌株（8.2 mg/L）相比提高了24.8%。本研究通过培养基优化策略和基因工程手段提高了菌株生产维生素B12的能力,基于原始组和优化组发酵过程的代谢组学分析,对丙酸杆菌生产维生素B12调控机制进行了解析,为全面解析丙酸杆菌生产维生素B12的调控机制提供了有价值的理论依据。
- 作者：
- 吴杰
- 学位授予单位：
- 大连工业大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2019年
- 导师姓名：
- 金朝霞；张大伟
- 中图分类号：
- TQ924
- 关键词：
- 12','','WnF2TBT；mmd2BifbttOL9cLzF6w5tZyTMMolHWN3kbGXAxcYoCPG6；mmd2B3tvBIWR6tlbbERz')；
；">维生素B12；费氏丙酸杆菌；统计实验设计；代谢组学；基因工程改造
-