基于尿液外泌体长链非编码RNA的膀胱癌早期诊断及机制研究
研究目的本课题主要是通过使用差速超速离心技术从膀胱癌患者尿液中提取外泌体（exosome）,并通过检测外泌体中lnc RNAs,探索其临床价值及分子机制。方法1.收集尿液选取通过组织病理确诊为膀胱癌的术前患者,筛选出其中未接受任何术前治疗的患者41例,收集晨尿。根据膀胱癌患者的性别及年龄挑选相匹配的正常人晨尿25例作为对照组。所有尿液样本均保存于-80℃冰箱。2.外泌体的提取和鉴定提取:利用低速离心和超速离心交替进行的方法（差速超速离心法）提取尿液中的外泌体。鉴定:（1）电子显微镜（TEM,Transmission Electron Microscopy）鉴定exosome形态;（2）纳米流式检测法检测exosome的粒径和浓度。（3）Western Blot检测exosome特异性标记蛋CD81、CD9和CD63。（4）流式细胞术检测exosome特异性抗体CD63。3.Lnc RNA的选取、提取、检测以及数据分析选取:查阅文献,筛选出与膀胱癌相关的4个lnc RNAs（UCA1,HOTAIR,BLACAT2,LINC00477）,q RT-PCR验证其表达量,选出表达差异显著的lnc RNAs（HOTAIR,BLACAT2,LINC00477）。提取:利用RNA提取试剂盒RNAsimple Total RNA Kit提取exosome中总RNAs,使用酶标仪测定总RNA的OD值,检测其浓度及纯度。检测:使用Evo M-MLV反转录试剂盒将RNA逆转录成c DNA,然后利用实时定量PCR技术检测UCA1,HOTAIR,BLACAT2,LINC00477的相对表达量。分析:比较膀胱癌患者和健康志愿者的尿液外泌体中UCA1,HOTAIR,BLACAT2,LINC00477的表达差异。联合检测HOTAIR,BLACAT2,LINC00477对膀胱癌的早期诊断价值。4、生存期分析使用TCGA数据库,分析出BLACAT2,HOTAIR,LINC00477与膀胱癌的预后关系。5、BLACAT2,HOTAIR,LINC00477的相关机制分析通过starbase,mi RCODE预测可能与BLACAT2,HOTAIR,LINC00477相结合的micr RNA。通过mi Randa,Targetscan,Pic Tar联合预测mi RNA的靶向基因进而使用KEGG和GO分析出BLACAT2,HOTAIR和LINC00477可能影响的通路和生物功能（p<0.05）。结果1、通过差速超速离心法提取,提取物通过TEM、纳米流式检测法、Western blot及流式细胞术鉴定,结果表明提取物中含有大量外泌体。2、q RT-PCR结果显示HOTAIR,BLACAT2,LINC00477在膀胱癌患者相对于健康志愿者尿液外泌体中均高表达,且差异具有统计学意义。3、通过多变量logistic回归模型分析,绘制ROC分析发现,HOTAIR,BLACAT2,LINC00477联合检测AUC为0.917。4、与Ta-T1期膀胱癌患者相比,LINC00477在T2-T4期的膀胱癌中上调,并与膀胱癌的侵袭相关（P=0.032）,其对应的ROC曲线下面积AUC为0.721。5、通过TCGA数据库分析发现HOTAIR高表达与膀胱癌不良预后明显相关。6、通过生物信息数据库预测与lnc RNAs相结合的micr RNAs,以及micr RNAs的靶向基因。然后分析出BLACAT2,HOTAIR和LINC00477可能影响的通路和生物功能。结论1、膀胱癌患者尿液外泌体中lnc RNAs（HOTAIR,BLACAT2,LINC00477）相对于健康人会出现表达差异。2、通过多变量logistic回归模型分析,绘制ROC分析发现,HOTAIR,BLACAT2,LINC00477联合检测有希望成为膀胱癌早期诊断的方法。
- 作者：
- 刘金检
- 学位授予单位：
- 深圳大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2020年
- 导师姓名：
- 吴松；李海军
- 中图分类号：
- R737.14
- 关键词：
- 膀胱癌；外泌体；尿液；lncRNA
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