去泛素化酶UCH-L5及POH1在脑胶质瘤发生发展中的作用及机制研究
脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,占原发性中枢神经系统肿瘤的36%以上,具有高发病率,高死亡率等特点。脑胶质瘤治疗主要以手术切除、放疗、化疗和药物联合等传统疗法为主,但治疗后患者预后差,易复发。脑胶质瘤发病机制尚不明确,深入研究胶质瘤发生发展中的关键蛋白分子及其调控机制,对于寻找胶质瘤治疗的新靶点及有效治疗药物具有重要意义。泛素蛋白酶体系统由泛素活化酶E1,泛素结合酶E2,泛素连接酶E3,去泛素化酶,26S蛋白酶体系统组成,是真核生物维持蛋白稳态的主要途径之一。去泛素化酶作为泛素蛋白酶体系统的成员之一,可以将单泛素分子或者多泛素链从被泛素化修饰的底物蛋白上特异性去除,使底物蛋白去泛素化,对蛋白稳态的调节发挥着重要作用。UCH-L5、POH1分别属于两种不同的去泛素化酶家族,UCH-L5属于UCHs家族,POH1属于JAMMs家族。生物信息学及临床组织样本检测发现:相较于脑正常组织,UCH-L5在脑胶质瘤组织中低表达,POH1在脑胶质瘤组织中高表达,提示UCH-L5、POH1可能参与了胶质瘤的发生发展。而UCH-L5、POH1在脑胶质瘤细胞增殖与肿瘤发生发展中的作用和分子机制尚有待进一步阐明。应用EDU分析法和克隆形成实验检测细胞增殖,我们发现敲低UCH-L5表达促进脑胶质瘤细胞U251细胞的增殖。我们实验室之前的研究已经证明稳定敲减UCH-L5促进U251细胞增殖与荷瘤裸鼠胶质瘤的生长;但是敲低UCH-L5对U87MG脑胶质瘤细胞增殖未见影响,机制不清楚。结合PTEN在U87MG细胞中缺失的文献报道,我们推测PTEN可能为UCH-L5的分子靶标。利用特异性siRNA干扰U251细胞中UCH-L5表达,Western blot检测蛋白表达发现U251中PTEN和磷酸化PTEN蛋白水平显著降低,RT qPCR结果显示PTEN mRNA水平没有变化。慢病毒介导的UCH-L5稳定敲低的U251细胞系中,PTEN和磷酸化PTEN蛋白水平显著下调。我们用抑制UCH-L5去泛素化酶活性的b-AP15抑制剂处理U251细胞,U251细胞中PTEN蛋白表达下调。在脑胶质瘤细胞系U251中干扰UCH-L5表达可促进PTEN蛋白的降解,该效应可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转,而溶酶体抑制剂CQ无作用。IP实验结果证实在胶质瘤细胞系U251中干扰UCH-L5表达可增加PTEN的泛素化。在HEK293细胞中,过表达UCH-L5可促进PTEN的去泛素化。因此,UCH-L5可能通过调节PTEN稳定性抑制U251胶质瘤细胞的增殖。TCGA数据库信息和脑组织芯片免疫组化结果表明,POH1在脑胶质瘤中是高表达的。CCK8结果表明敲低POH1抑制了A172脑胶质瘤细胞增殖,流式结果显示敲低POH1促进A172脑胶质瘤细胞凋亡。Transwell和划痕实验证明敲低POH1抑制A172细胞迁移和侵袭。我们通过查阅文献和实验验证,进一步探索了POH1调节脑胶质瘤发生的分子机制。Western blot检测相关蛋白表达,敲低POH1抑制TGF-β/Smads信号通路活化,下调TGF-β/Smads信号通路下游转录因子ZEB1蛋白表达,RT qPCR结果显示敲低POH1不影响ZEB1 mRNA水平。应用蛋白合成抑制剂CHX处理A172细胞,敲低POH1导致ZEB1蛋白稳定性降低。在脑胶质瘤细胞系A172中干扰POH1表达可促进ZEB1蛋白的降解,该效应可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转,而溶酶体抑制剂CQ无作用。TCGA数据库信息显示,在低级别胶质瘤患者中,POH1与ZEB1表达成正相关。本研究中,我们发现UCH-L5可调节PTEN蛋白稳定性抑制U251脑胶质瘤细胞增殖。POH1促进A172脑胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭,抑制A172脑胶质瘤细胞凋亡,相关机制可能与POH1调控ZEB1稳定性有关。这些结果提示UCH-L5及POH1可作为胶质瘤治疗的潜在靶点,对寻找胶质瘤治疗的新方式提供了思路与实验依据。
- 作者：
- 马文静
- 学位授予单位：
- 深圳大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2020年
- 导师姓名：
- 陈玮琳
- 中图分类号：
- R739.41
- 关键词：
- 泛素羧基端水解酶L5；人第10号染色体缺失的磷酸酶；26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基14；锌指转录因子1；脑胶质瘤
-