新疆南疆地区奶牛乳源金黄色葡萄球菌分子特性研究

奶牛乳房炎（Bovine mastitis）是奶牛养殖业中最为常见疾病的之一,可引起奶牛产奶量下降甚至丧失,同时伴随着奶质的降低,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。病原菌感染是引起奶牛乳房炎的主要原因,而金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。本研究采集新疆南疆地区部分规模化奶牛养殖场的乳样,从中分离鉴定金葡菌。采用多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）和葡萄球菌A蛋白分型（Staphylococcal protein A,spa）的方法对金葡菌进行分型。同时检测分离株对抗菌药物的敏感性和生物膜形成能力,评价生物膜形成相关基因和毒素基因携带率,为南疆奶牛健康养殖提供实验依据。MLST分析结果表明,107株金葡菌分属于44个ST型（序列型,Sequence typing）,其中41个ST型为本研究首次发现,占本研究确定总ST型的93.2%。41个新ST型中,来源于阿克苏地区的有24个,来源于巴州地区的有17个。在巴州地区占优势的分子分型为ST5406和ST5405。而阿克苏地区的金葡菌序列型较分散,没有发现较高比例的优势分子分型。通过对44种ST型进行聚类分析,归为5种克隆复合群（Clonal complex,CC）,其中CC81、CC88两个克隆复合群来自阿克苏地区,CC5405、CC5406两个克隆复合群来自巴州地区,CC398为两个地区共有的克隆复合群。spa分型结果表明,107株金葡菌分属于9种spa型,其中t5100、t2970、t2592、t1764 4种spa型来源于阿克苏地区,t189、t519、t1451、t571 4种spa型来源于巴州地区,t034为两个地区共有的spa型。分子分型结果显示出新疆南疆地区乳源金葡菌分子分型的多样性。采用K-B法和微量肉汤稀释法检测了107株金葡菌对14种抗菌药物的敏感性。结果表明,分离株对青霉素G、红霉素和克林霉素表现为极高的耐药性,耐药率分别为72.0%（77/107）、64.5%（69/107）和58.9%（63/107）。有19.6%（21/107）的金葡菌没有表现出对任何一种所检测药物的耐药性,9.3%（10/107）的菌株表现出对1种抗菌药物的耐药性,13.3%（14/107）的菌株表现出对2种抗菌药物的敏感性,57.9%（62/107）的菌株表现为对3种及以上抗菌药物耐药的多重耐药现象（Multidrug-resistant,MDR）。同时,本研究还对107株菌做了MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,Methicillin-resistantS.aureus）检测,结果表明有3株菌为MRSA菌株,均分离自同一地区。采用微量板半定量法检测了107株分离株的生物膜形成能力。结果表明,有12株菌（11.2%,12/107）生物膜形成能力较强,38株菌（35.5%,38/107）表现出中等的生物膜形成能力,56株菌（52.3%,56/107）生物膜形成能力较弱。PCR技术检测生物膜形成相关基因,发现clfa、clfb、cna、sarA、sigB在所有分离株中均存在,而bap和agrC在所有菌株中均未检测到。其次检出率较高的基因分别为ccp（94.4%）、luxS（87.0%）、tcaR（86.0%）和icaA（58.9%）基因。对15种毒力基因,包括肠毒素基因（Staphylococcal Enterotoxin,SE）、中毒性休克综合征基因（Toxic shock syndrome toxin,TSST）、溶血素基因（Hemolysins,HL）、杀白细胞素基因（Panton-Valentine leukocidin,PVL）和剥脱性毒素基因（Exfoliative toxin,ET）等进行检测。pvl基因检出率为54.2%（58/107）,且88.6%的CC5406型菌株（31/38）均含有pvl基因。eta的基因检出率为26.2%（28/107）,未检测到etb基因。20.6%的菌株（22/107）含有tsst基因,且只存在于CC81和CC5406克隆群中,其他克隆群未检测到该基因。溶血素基因hlb在所有菌株中均存在,hla基因的检出率为98.1%（105/107）。肠毒素基因see在所有菌株中均未检测到。其它肠毒素基因的检出率分别为sea（12.1%,13/107）、seb（4.7%,5/107）、sec（24.3%,26/107）、sed（41.1%,44/107）、seg（1.9%,2/107）、seh（25.2%,27/107）、sei（57.0%,61/107）、sej（5.6%,6/107）。其中seh基因在来源于阿克苏地区金葡菌的检测率为90%（27/30）,sei基因以较高检出率存在于CC5405（66.7%,22/33）和CC5406（97.4%,37/38）两个克隆群中。本研究通过对分子分型和生物膜相关检测、毒素基因检测和药物敏感性整合分析发现,CC5405和CC5406作为本研究所发现的新的克隆复合群,其有着强生物膜形成能力和高生物膜形成基因检出率。同时,这两个克隆复合群有着很高的毒素检出率。如,CC5406-t519型的pvl基因和sei基因的检出率高于85%。而CC5405-t189型有着高的溶血素基因、sea和seb基因。CC5406-t519型对红霉素、青霉素和克林霉素的耐药率均高于80%。相较于这两个克隆复合群,CC81、CC88、CC398的耐药性和毒素基因检出率相对较低。