新疆羊痘病毒分离株ANK基因家族序列分析及其缺失对宿主细胞转录水平的影响
羊痘是由羊痘病毒引起羊的一种急性、接触性传染病,在世界范围流行。羊痘病毒含有5个ANK基因,推测其与病毒的宿主范围有关,本论文对5株新疆羊痘病毒分离株及疫苗株的ANK基因序列进行比较分析,并在缺失ANK基因的情况下研究其对病毒复制和宿主细胞的影响。得到结果如下:1.成功克隆6株羊痘病毒ANK基因30个,经测序及序列分析表明,ANK基因138共有55个核苷酸产生突变,导致25个氨基酸产生突变;ANK基因140共有44个核苷酸产生突变,导致17个氨基酸产生突变;ANK基因141.2共有40个核苷酸产生突变,导致23个氨基酸产生突变;ANK基因145共有55个核苷酸产生突变,导致26个氨基酸产生突变。从遗传进化树来看,新疆株与印度株亲缘关系最接近,特别是ANK010基因,新疆株直接与印度毒株独立聚于一支,与其他毒株有明显差异。对于其他4个ANK基因,各新疆株均与其他参考株分别聚成GTPV和SPPV两个种系,且同种系中新疆株与印度株仍然较为亲近。不同的是新疆分离株GTPV-SS,其5个ANK基因均与SPPV种系聚于一簇,推测该毒株可能是SSPV跨物种传播给山羊的结果。2.本研究成功制备了绵羊睾丸原代细胞,且能够稳定传代至10代左右,能够在冻存,复苏后继续良好的生长。构建了30个ANK基因缺失的表达载体,与各自毒株重组得到了30个重组病毒,经挑斑法纯化,得到了rM1?ANK141、rThx?138、rThx?141.2等3株纯化的基因缺失重组病毒。对rM1?ANK141毒株、M1毒株分别液接种Vero、293T、BHK-21以及羊睾丸细胞,观察重组病毒与原病毒在24 h、48 h、72 h、96 h对不同细胞嗜性的影响,结果表明rM1?ANK141毒株在羊睾丸原代和Vero细胞中生长情况良好,与M1毒株的生长情况没有明显差异;在293T细胞和BHK-21细胞上初期有明显的荧光出现,但随着时间延长没有明显的增多现象,相对M1毒株生长较好。3.对ANK基因141.2进行RNA干扰后,转录组测序结果的GO分析表明:富集项中实验组与对照组主要差异表现在细胞组成部分,主要影响核小体、DNA包装复合体、呼吸链以及呼吸链复合体的功能,其差异基因由10到15个不等,GO注解的基因均为377个;下调基因差异也体现在细胞组成部分,主要影响与呼吸链相关的功能;上调基因主要差异分布在生物过程和细胞组成,生物过程主要影响细胞蛋白质代谢过程以及pro-B细胞分化调控过程,而细胞组成部分主要影响与染色体和DNA包装有关的功能。KEGG分析表明:RNA干扰对宿主细胞的12个通路受到了影响,其中有3个富集项,分别是Parkinson’s disease（帕金森综合症）信号通路、Oxidative phosphorylation（氧化磷酸化）信号通路、Metabolic pathways（代谢途径）信号通路;对于病毒基因拷贝数的分析表明,共检测到120个病毒基因,与对照相比,RNA干扰后24个基因拷贝数上调,39个基因拷贝数下调,57个基因基本没有变化。推测ANK基因对病毒各基因的转录有影响,但对整个病毒复制的影响不确定。
- 作者：
- 张雪萍
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2020年
- 导师姓名：
- 李有文
- 中图分类号：
- S852.654
- 关键词：
- 羊痘病毒；ANK基因；重组病毒；转录组测序
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- 基金项目：
- 国家自然科学基金项目"《基于宿主范围基因ANK的山羊痘病毒跨物种感染的分子机制研究》"的部分研究成果(项目编号:31760741),课题主持人:李有文 教授(塔里木大学)