胡杨异形叶发生相关lncRNA的鉴定及功能研究

胡杨是荒漠地区特有的珍贵森林资源,是塔克拉玛干沙漠唯一的天然乔木树种。胡杨有很强的生命力,具有耐盐、耐碱、耐寒、耐旱、抗风沙的特性。在新疆南部塔里木河中上游河岸以及下游地区广泛的分布着大量的胡杨林,这些胡杨林对常年沙尘天气地区的防风固沙、调节地区气候、有效阻挡沙漠北移,以及保护绿地周边地区的居民安定生活等方面,发挥了重要的积极作用。胡杨具有明显的异形叶性,其叶片的形状会随着树龄发生变化——幼龄胡杨的叶片全部为披针形叶,像是柳树的叶片,随着胡杨树树龄的增加,比较靠上层的树冠逐渐出现菱形叶、肾形叶、卵圆形叶和宽卵圆形叶,像是杨树的叶片。胡杨的这种典型异形叶性,是胡杨在生长发育不同时期长期适应荒漠环境的表现,对抵御不良环境起着重要作用。目前,大多数关于胡杨异形叶性研究主要集中在形态结构水平,而在分子水平研究胡杨异形叶发生的分子机制还很少。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是广泛存在于真核生物中的一类转录本长度超过200nt,并且不编码蛋白质的RNA。研究表明,在动物中,lncRNA与染色质修饰、X染色体沉默、调控转录、调控级联反应等过程密切相关,并且还参与调控生物体的生长发育以及细胞生长分化、增殖、凋亡等重要的生命活动。在植物中,lncRNA对植物营养生长阶段转变、生殖发育过程也起着重要的调控作用。因此,为探索lncRNA在胡杨异形叶发生过程中的作用,本研究以胡杨条形叶、披针形叶、卵圆形叶和宽卵形叶等四种异形叶为研究材料,综合利用链特异性转录组测序（二代测序）和全长转录组测序（三代测序）,鉴定出胡杨叶组织lncRNA的种类,并根据lncRNA的表达模式,确定胡杨异形叶发生相关的lncRNA;然后用生物信息学方法构建出lncRNAmiRNA-mRNA在胡杨异形叶发生中的分子调控网络,进一步比较分析和预测胡杨上述四种叶形差异lncRNA及靶基因功能,并结合qPCR等分子技术检测调控网络中的关键RNA在胡杨四种叶形的表达情况,对lncRNA在胡杨异形叶发生中作用进行初步解析。本研究获得的结果如下:1.在胡杨叶组织中共发现1977个新lncRNA。通过二代测序与三代全长转录组测序,获得高质量胡杨异形叶转录组数据,以转录本长度（≥200bp）、外显子（个数≥2）等为基本筛选条件,再经过CPC（score<0）、CNCI（score<0）、PLEK（score<0）、pfam蛋白结构域分析序列潜在编码能力筛选（E-value<0.001）等生物信息学分析工具,取得上述筛选结果交集的lncRNA。最终在胡杨叶片组织中获得了1977条新lncRNA。2.鉴定出552个与胡杨异形叶发生相关的lncRNA。利用本课题组获得的胡杨条形叶、披针形叶、卵圆形叶、宽卵圆形叶的四种形状叶组织转录组数据,进行表达差异分析,研究胡杨1ncRNA是否对胡杨异形叶的发生有影响。以在不同叶形间表达量FoldChange>2且p<0.05为筛选条件,最终得到552个胡杨异形叶发生相关的lncRNA。其中以条形叶为对照,本研究发现条形叶、披针形叶中共有157个差异lncRNA,其中有57个lncRNA呈下调表达,有100个lncRNA是上调表达;在条形叶、卵圆形叶中共有207个差异lncRNA,其中有75个lncRNA下调,有132个lncRNA是上调表达;条形叶、宽卵圆形叶中共有215个差异lncRNA,其中有105个lncRNA下调,有110个lncRNA是上调表达。以披针形叶为对照,发现披针形叶、卵圆形中共有55个差异lncRNA,其中有22个lncRNA为下调表达,有33个lncRNA是上调表达;在披针形叶、宽卵圆形叶中共有142个差异lncRNA,其中有72个lncRNA下调,有70个lncRNA是上调表达。以卵圆形叶为对照,发现卵圆形、宽卵圆形叶中共有156个差异lncRNA,其中有86个lncRNA为下调表达,有70个lncRNA呈上调表达。最后利用qPCR技术对筛选出的关键RNA表达情况进行了验证,与测序结果基本一致。3.构建了胡杨异形叶中lncRNA-miRNA-mRNA表达调控网络。我们根据竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）假说及共表达分析,构建了lncRNAmiRNA-mRNA表达调控网络。发现有50个lncRNA通过25个miRNA调控284个mRNA的表达。利用qPCR技术对筛选出的关键调控关系验证,与预测结果基本一致。4.预测了胡杨异形叶中lncRNA的生物学功能。根据靶基因（mRNA）的功能对胡杨异形发生相关的lncRNA的功能进行了预测。发现胡杨异形叶发生相关的lncRNA可能通过调控靶基因参与了包括应激响应、生长发育、物质代谢、信号转导等在内的多种生物学过程。这些lncRNA通过调控下游靶基因参与胡杨异形叶发生的调控,如TCONS₀0004524、TCONS₀0017878、TCONS₀0056727、TCONS₀0065259和TCONS₀0057022在胡杨卵圆形叶中上调表达,从而影响其下游靶基因yoda（XM₀11030993.1）的上调表达导致叶片局部细胞增殖,可能促进胡杨叶片的变宽。上述结果暗示lncRNA可通过调控miRNA及编码基因参与调节胡杨异形叶的发生。总之,本研究利用二代和三代测序,筛选出1977个胡杨新lncRNA,鉴定出551个胡杨异形叶发生相关的lncRNA,发现其中50个lncRNA通过ceRNA机制调控靶基因,从而影响生长发育、物质代谢、信号转导等生物学过程参与胡杨异形叶的发生,表明lncRNA在胡杨异形叶的发生中有重要的作用。本研究提供了胡杨异形叶长链非编码RNA数据信息,为后续研究胡杨异形叶发生分子机制提供有用的基因资源,对研究植物形态发育机制具有重要的参考价值。