一株放线菌新物种抑制白色念珠菌生物膜形成活性成分分析及作用机制初探
白色念珠菌（Candida albicans）是医院真菌感染的主要致病菌之一。近年来,随着广谱抗生素,皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用,使得真菌感染的发病率和死亡率逐年上升。生物膜（biofilm,BF）的形成有助于帮助真菌躲避免疫系统的清除和药物的攻击,使治疗白色念珠菌感染变得更困难,因此,开发新型抗菌剂迫在眉睫。放线菌能够产生丰富的次级代谢产物,是挖掘生物活性物质的宝库。本实验利用新疆南疆地区丰富的微生物资源,筛选抑制白色念珠菌BF形成的菌株,确定分类地位,通过基因组测序信息分析发现活性相关基因,明确活性次级代谢产物的成分,探究抑膜机制,为抗膜剂新药的研发提供理论依据。1、以白色念珠菌为靶标菌,采用微孔板定量法,对流动风沙和连作棉田来源的170株放线菌进行筛选,结果表明,TRM43335、TRM43290、TRM43259等6株放线菌对白色念珠菌BF形成有抑制作用。2、基于表观特征、化学特征、基因型特征对菌株TRM43335T进行多相分类,确定该菌株为一株链霉菌新物种,命名为塔克拉玛干链霉菌。该菌株具有丰富的白色气生菌丝体,偶尔扭曲并分化成螺旋孢子链,每个孢子呈椭圆形,表面光滑,其在37℃,pH 8和1%（w/v）NaCl的存在下生长最佳。DNA的G+C含量为72.8 mol%。菌株TRM43335T能够利用主要糖为核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖;主要磷脂是双磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerol,DPG）、磷脂酰肌醇甘油酯（phosphatidylethanolamine,PIM）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol,PG）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylinositol,PE）;主要的甲基萘醌是MK-9（H6）;主要的细胞脂肪酸（>5%）为iso-C16:16:1 H（18.18%）、anteiso-C15:0（16.96%）、iso-C16:0（16.30%）、anteiso-C17:0（12.58%）、anteiso-C17:17:1 w9c（10.64%）和iso-C15:0（5.30%）。LL-二氨基庚二酸（LL-diaminopimelic acid,LL-DAP）作为菌株TRM43335T的全细胞诊断氨基酸。16S rRNA基因序列分析表明,菌株TRM43335T与Streptomyces desertarenae SYSU D8023T的序列相似性最高98.69%。与最高相似菌株之间的平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity,ANI）相关性和DNA-DNA杂交（DNA-DNA hybridization,dDDH）值分别为89.23%和36.70%。保藏号为TRM43335T（CCTCC AA 2018052T=KCTC 49254T）3、利用Nanopore测序技术对菌株TRM43335T进行了全基因组的测序,并通过各种生物信息学分析工具对其进行合理分类和注释。最终获得了长度为6136714 bp的全基因组序列,其中5163个基因进行了明确的功能注释。4、通过硫酸铵沉淀法对菌株TRM43335T发酵液蛋白质进行提取。使用Sephadex G-100层析柱和DEAE离子交换层析柱进行分离纯化,并使用SDS-PAGE进行检测。活性检测发现馏分C、D、E活性好,并进行后续的理化因素的探究,结果表明该馏分对热不敏感,对酸碱较稳定,pH值为7时抑膜活性降低,金属离子和有机试剂对抑膜无促进作用。通过牛乳平板实验、表面疏水性实验、降解胞外DNA实验对馏分蛋白抑制白色念珠菌BF的形成机制进行测定。结果表明馏分C与D蛋白可以水解胞外蛋白和降低表面疏水性,E蛋白既可以水解胞外蛋白,降低表面疏水,还可以降解胞外DNA。
- 作者：
- 袁琳琳
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2020年
- 导师姓名：
- 曾红
- 中图分类号：
- Q935
- 关键词：
- 放线菌；多相分类学；白色念珠菌；生物膜；基因组测序分析；抑制作用
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- 基金项目：
- 国家自然科学基金项目"塔里木盆地放线菌资源代谢潜力的深度挖掘"的部分研究成果(项目编号:U1703236)课题主持人:张利莉教授(塔里木大学)