PK2/PKRs在二甲双胍保护糖尿病睾丸损伤中的作用
目的:研究PK2/PKRs在糖尿病睾丸损伤中的作用,进而研究PK2/PKRs在二甲双胍保护糖尿病睾丸损伤的作用机制。方法:第一部分,160只18-22 g SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为正常对照组（control组,n=60）、糖尿病模型组（DM组,n=100）。适应性喂养一周后,小鼠禁食不禁水12 h,DM组小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素(STZ,50mg·kg-1·d-1,临用前用0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH4.4配成10 mg/mL浓度使用),control组小鼠同时段连续5天腹腔注射等容量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。STZ注射7天内监测小鼠随机血糖,随机血糖均≧16.7 mmol/L的小鼠被诊断为糖尿病小鼠,随后每周监测一次随机血糖。在诊断糖尿病后2个月（2M）、3个月（3M）、4个月（4M）、5个月（5M）的时间点麻醉小鼠并进行安乐死,迅速取出睾丸组织并保存,摘取小鼠附睾尾部进行精子活力及精子浓度计数,光学显微镜下观察小鼠睾丸组织结构,Western blot检测小鼠睾丸组织中PK2、PKR1、PKR2、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达变化。第二部分,70只18-22 g SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分为正常对照组（control组,n=20）、糖尿病模型组（DM组,n=25）,二甲双胍治疗组（DM+Met组,n=25）,糖尿病模型构建及诊断同第一部分。DM+Met组小鼠诊断为糖尿病后予以250 mg·kg-1·d-1的盐酸二甲双胍溶液饮水,持续4个月,其余各组给予凉开水。Met治疗4个月后麻醉小鼠并进行安乐死,迅速取出睾丸组织并保存,摘取小鼠附睾尾部进行精子活力及精子浓度计数,光学显微镜下观察小鼠睾丸组织结构,荧光显微镜下观察睾丸组织血睾屏障完整性,透射电镜观察睾丸细胞超微结构变化。末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL）染色法观察睾丸组织的凋亡情况,免疫组化法及RT-qPCR观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、PCNA和PK2、PKR1、PKR2的表达情况;Western blot检测小鼠睾丸组织PK2、PKR1、PKR2、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β、Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白P62、LC3B、Beclin-1蛋白表达变化。结果:与control组相比,DM组小鼠毛发稀疏无光泽,随机血糖持续升高（P<0.05）,伴随糖尿病造模时间的延长,小鼠体重和睾丸重量逐渐下降（P<0.05）,精子活力和精子浓度明显减少（P<0.05）,睾丸生精小管失去典型结构,并且糖尿病小鼠在不同时间点PK2、PKR2、p-Akt和p-GSK3β水平均显著降低（P<0.05）,而PKR1水平显著升高（P<0.05）,这些变化通过Met治疗后得到了恢复。此外,Met还可以修复睾丸组织血睾屏障的完整性,减弱睾丸组织凋亡相关蛋白表达（P<0.05）并诱导自噬相关蛋白表达（P<0.05）。结论:通过多次小剂量注射STZ(50 mg-1·kg-1·d-1)的方法成功造模糖尿病小鼠模型,并随着病程的延长小鼠睾丸组织损伤逐渐加重,PK2/PKRs在小鼠糖尿病睾丸损伤中发挥不可替代的作用。Met可通过抑制细胞凋亡和诱导自噬来挽救糖尿病所致的睾丸损伤,其机制可能是通过PK2/PKR/Akt/GSK3β信号通路。
- 作者：
- 刘宇宁
- 学位授予单位：
- 湖北科技学院
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2020年
- 导师姓名：
- 查文良；孔东波
- 中图分类号：
- R965
- 关键词：
- 糖尿病；PK2；PKR；Akt/GSK-3β；细胞凋亡
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