微囊藻毒素LR单克隆抗体的制备及其应用研究
DeveLopment and Application of monocLonaL Antibodies Against microcystins-LR
微囊藻毒素LR(Microcystin-LR,MC-LR)是淡水中毒性最强、急性危害最大的淡水蓝藻毒素之一,靶器官为肝脏,具有遗传毒性和致癌性.我国由于水体富营养化严重,蓝藻水华现象时有发生,再加上MC-LR性质稳定,在水体中降解速度缓慢,MC-LR可以通过饮用水和被污染的水产品进入人体,严重威胁人类健康.目前MC-LR的检测方法以生物分析法、化学分析法和免疫分析法为主,其中免疫分析法以检测成本低、灵敏度高、检测通量大等优点成为MC-LR主流的筛选检测方法.本论文以MC-LR为研究对象,直接利用其游离羧基与载体蛋白偶联合成两种人工抗原,成功筛选制备了具有识别MC-LR的单克隆抗体,并构建了相应的免疫学检测方法,主要结果如下:1、MC-LR人工抗原的合成与鉴定:MC-LR为小分子物质,分子量在1000 Da之间,需与大分子蛋白偶联.试验直接利用MC-LR第3位D-β-Me-天冬氨酸和第6位D-谷氨酸中的2个游离羧基,选择碳二亚胺方法与钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)进行反应偶联免疫原与包被原,制备两种人工抗原(MC-KLH和MC-BSA).并采用紫外扫描光谱、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)三种方法对两种人工抗原进行鉴定.结果表明紫外扫描光谱法可观察到两种人工抗原的紫外吸收谱与载体蛋白相比发生改变.通过SDS-PAGE法可以观察到MC-BSA分子量比BSA增大.另外质谱法测定的MC-BSA的相对分子量为76515.84 Da,计算得到的MC-LR与BSA的偶联比为10:1.试验成功合成了 2种微囊藻毒素LR的人工抗原,为其单克隆抗体的制备奠定了基础.2、MC-LR单克隆抗体的制备方法:试验以前期合成的MC-KLH为免疫原与弗氏佐剂乳化后,免疫了 3只BaLb/c系小鼠.经5次免疫后,用ELISA法测定了小鼠的抗血清效价及敏感度.结果表明,1号小鼠抗血清效价最高,达到1:32000倍,MC-LR对鼠血清的抑制中浓度(IC50)为0.53μg/mL.随后试验选用1号小鼠取其脾脏与处于对数生长小鼠骨髓细胞SP2/0,在PEG1500的作用进行细胞融合,脾细胞与SP2/0的融合比例为10:1.融合细胞用选择性培养基进行培养,在观察到杂交瘤生长面积约占微孔板底面积1/10时,采用间接非竞争性ELISA法和间接竞争性ELISA法对杂交瘤进行两轮鉴定,阳性克隆通过有限稀释法完成单抗建株,其中细胞株2A9,经过连续传代和冻存后复苏鉴定,能够稳定分泌识别MC-LR的单克隆抗体.随后试验通过腹水法制备了 2A9腹水,首先使用饱和硫酸铵法进行初步纯化,之后使用Protein G柱进行亲和纯化.纯化后的单克隆抗体,采取间接ELISA法测定其抗体亚型为IgG2b型,抗体亲和常数为2.4*107L/mol,属于中高等亲和抗体.3、MC-LR间接竞争ELISA测定方法的建立:试验采取方阵滴定法确定的包被抗原MC-BSA以及腹水的最佳工作浓度分别为2.5 μg/mL和1:500倍稀释.在优化的工作浓度下,建立了微囊藻毒素LR的间接竞争ELISA检测方法.结果表明,抗体的IC50为3.42 μg/mL,最低检测限为0.10 μg/mL.对结构类似物MC-RR的交叉反应率为66.25%.最后试验通过对不含有MC-LR的湖水以及自来水进行了三个水平添加,方法的添加回收率和相对标准偏差分别在74.22-92.23%和1.87-9.31%之间.本论文建立的微囊藻毒素LR间接竞争性ELISA测定方法可以满足于螺旋藻等保健食品中高浓度MC-LR的含量检测,2A9单克隆抗体也有潜力被应用于免疫亲和柱的研发.
- 作者：
- 何丹
- 学位授予单位：
- 安徽科技学院
- 专业名称：
- 农业(专业学位)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 李先保；刘媛
- 中图分类号：
- X52
- 关键词：
- 微囊藻毒素LR；人工抗原；单克隆抗体；ELISA
- Microcystin-LR; artificial antigens; monoclonal antibodies; ELISA;