利用CRISPR/Cas9技术构建C57 BL/6小鼠免疫缺陷动物模型
Construction of C57 BL/6 Mouse Immunodeficiency Animal Model by CRISPR/Cas9 Technology
随着分子免疫学的发展,C57 BL/6小鼠成为了研究免疫学、肿瘤学、遗传学的常用实验品系,该小鼠易于繁殖,体格健壮,试验结果精度高.免疫缺陷动物是指先天性遗传或者人为地造成免疫缺陷地动物,常用于肿瘤、病理、抗癌药物、基因治疗,是进行生物医学研究的有利工具.本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了C57 BL/6小鼠免疫缺陷动物模型,对其免疫特性进行研究,探索免疫细胞在动物模型中的表达规律.论文的主要内容如下:1、构建lyst基因缺陷C57 BL/6小鼠动物模型溶酶体运输调节因子基因(lysosomal trafficking regulator gene,lyst)是先天性白细胞颗粒异常综合征(Chediak-Higashi综合征)的致病基因,患病机体的临床表现为:色素减退,免疫缺陷、畏光羞明,轻度凝血障碍等.本研究采用CRISPR/Cas9技术针对C57BL/6小鼠lyst基因编码区第50个外显子,设计靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-lyst-sgRNA载体.将重组质粒与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,注射入小鼠受精卵,将其移植到受体小鼠.获得子代小鼠后,利用PCR和基因测序技术,筛选lyst基因编辑的动物个体,通过生物信息分析软件判断基因发生的缺失、突变或插入,并用流式细胞检测其免疫特性;根据基因型同源性合笼近亲繁殖;最终获lyst基因缺陷C57 BL/6小鼠.试验结果,利用CRISPR/Cas9技术构建lyst基因缺陷C57BL/6小鼠,其NK细胞数量与同品系野生小鼠相比减少,部分缺陷小鼠毛色与同品系野生型小鼠毛色相比颜色变淡,与文献报道相符.为后续NK细胞免疫缺陷的人源化肿瘤研究及C57 BL/6小鼠严重联合免疫缺陷动物模型奠定基础.2、构建prkdc基因缺陷C57 BL/6小鼠动物模型DNA依赖性蛋白激酶基因(DNA-dependent protein kinas,prkdc)功能障碍可直接影响T、B细胞的表达,使得机体产生严重联合免疫缺陷.本研究采用CRISPR/Cas9技术针对C57 BL/6小鼠prkdc基因编码区第85个外显子,设计靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-prkdc-sgRNA载体.将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,注射入小鼠受精卵,将其移植到受体小鼠.获子代小鼠后,利用PCR检测技术和基因测序技术,筛选prkdc基因编辑的动物个体,对基因组编辑的小鼠根据基因型同源性合笼近亲繁殖.实验结果:最终构建了prkdc基因缺陷C57 BL/6小鼠,其T、B细胞的数量与同品系野生小鼠相比减少,甚至出现T、B细胞量几乎为零的小鼠,基因编辑小鼠生长缓慢与文献报道相符.可用于T、B细胞免疫缺陷的人源化肿瘤研究,为基因治疗及C57 BL/6小鼠严重联合免疫缺陷动物模型奠定基础.综上所述,利用CRISPR/Cas9技术,分别构建了C57 BL/6小鼠的lyst基因和prkdc基因的免疫缺陷动物模型,该小鼠模型体内免疫细胞数量降低.为下一步进行人源化肿瘤研究、构建C57 BL/6小鼠严重联合免疫缺陷动物模型及分子免疫的研究奠定基础.
- 作者：
- 艾东旭
- 学位授予单位：
- 塔里木大学
- 专业名称：
- 微生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2019年
- 导师姓名：
- 李莲瑞；孙兆增
- 中图分类号：
- R593.3；R-332
- 关键词：
- CRISPR/Cas9技术；lyst基因；prkdc基因；免疫缺陷；动物模型
- CRISPR/Cas9 technology; lyst gene; prkdc gene; immunodeficiency; animal model;