新型适冷纤维素酶的酶学鉴定及功能位点研究
Enzymatic Identification and Functional Site Study of A Novel Cold-active Cellulase
随着资源短缺问题的加剧,人们开始将目光放在可再生资源上,作为世界上产量极丰富的纤维素资源,其可通过纤维素酶的分解产生葡萄糖等,为进一步的加工提供原料.本实验在新的纤维素酶基因克隆、表达、酶学性质和功能位点上做了系统的研究,主要研究内容如下:1.从低温气候的西藏地区采样获得了两种可以分解纤维素的菌株Microbacterium kitamiense和Zhihengliuella halotolerans,并成功克隆了四个新型纤维素酶基因,Mkcel5A、MkcelB、ZhcelA和ZhcelB,通过刚果红染色法验证这四个基因编码的蛋白有纤维素酶活力,进一步的表达发现其中三个蛋白为包涵体,另一个表达量较低.2.对四个基因中的一种纤维素酶基因MkCel5A进行深入研究,结果显示其基因的开放阅读框大小为1449 bp,编码了一个大小为482个残基的多肽,分子量为51.38 kDa.序列分析表明MkCel5A蛋白属于糖基水解酶家族5(GH5),并且与内切葡聚糖酶同源性很高.对MkCel5A蛋白经过复性和纯化处理后发现,其最适催化温度为25℃,最适催化pH为7.0,金属离子Rb+和Co2+等可促进酶活力,Cu2+、Mn2+、SDS和EDTA等降低了酶的活性.以CMC-Na为反应底物时,Vmax为1.51 mmol/min*mg,Km值为42.11 mg/mL,野生型酶的标准酶活力为0.6 U/mg.值得注意的是,MkCel5A的最适温度为25℃,在0℃时十分稳定.该酶是一种从未被报道的新型冷活性纤维素酶,对冷活性纤维素酶的功能研究具有参考意义,并且有机会应用于纤维素加工业,特别是低温加工业.3.通过预测和模拟发现MkCel5A蛋白质的结构具有纤维素酶家族典型的碳水化合物结合域(CBD)和催化域(CD).基于结构的序列比对分析结果显示,MkCel5A的催化结构域312和404位的两个谷氨酸在GH5家族纤维素酶中十分保守,是催化过程中重要的活性位点.本实验使用定点突变技术,将312和404位的谷氨酸突变成丙氨酸,突变体蛋白经过纯化和复性后,突变体E312和E404的绝对酶活力分别为0.003和0.005 U/mg,在CMC平板上的水解圈较小.单点突变实验证明了312和404位的两个谷氨酸是催化过程中重要的活性位点.本研究发现了四个新的纤维素酶基因,并且MkCel5A作为一种新型冷活性酶,为发现较少的冷活性纤维素酶家族增加新的成员,在工业生产和酶的功能研究中有着潜在的价值.
- 作者：
- 李媛媛
- 学位授予单位：
- 安徽师范大学
- 专业名称：
- 生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2019年
- 导师姓名：
- 林凌
- 中图分类号：
- Q55
- 关键词：
- 纤维素酶；冷活性酶；Microbacterium kitamiense；定点突变；蛋白质建模
- cellulase; cold-active enzyme; Microbacterium kitamiense; site-directed mutagenesis; protein modelling;