骨形态发生蛋白-7通过调节Smad信号通路平衡发挥抗矽肺纤维化作用的机制研究
Antagonisms and Mechanisms of Bone Morphogenetic Protein-7 on Silica-induced Pulmonary Fibrosis through Modulating the Balance of Smad Signaling Pathway

矽肺是由于在生产过程中长期吸入较高浓度的游离二氧化硅粉尘而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主的疾病.基本的病理学变化为矽结节的形成和弥漫性间质纤维化.矽肺的病因明确但发病机制极其复杂且尚未完全阐明.上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在器官纤维化中发挥至关重要的作用,而转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)作为最重要的致纤维化因子能够诱导EMT的发生并导致上皮细胞发生间质化样改变.骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7)来源于 TGF-β 超家族,目前认为其具有气道重构、保持上皮细胞表型、抑制EMT、抗凋亡等作用,近年来BMP-7在抗纤维化中的作用逐渐得到重视.文献报道BMP-7具有抗纤维化作用,这一作用在心、肝、肾、肺都有一定的研究.但截至到目前为止,关于BMP-7抑制石英诱导矽肺纤维化的作用及其机制的研究报道还尚不充分,在分子机制探讨方面还不够深入.本研究旨在:(1)研究石英诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(rat lung epithelial-T-antigen negative,RLE-6TN)发生 EMT 及间质化样改变的分子机制;(2)探讨BMP-7如何调节Smad信号通路平衡,从而抑制或延缓肺上皮细胞间质化样改变的发生发展.第一部分Smad通路参与石英诱导的RLE-6TN细胞EMT及间质化样改变目的:阐明石英是否能够在体外诱导RLE-6TN细胞发生EMT及间质化样改变,并且调节经典的Smad信号通路发生改变.方法:RLE-6TN和RAW264.7细胞冻融、传代至第三代细胞用于实验.分别使用0、25、50、100μg/mL的石英混悬液作用于RAW264.7细胞24h收集上清液刺激RLE-6TN细胞作用48h,进行剂量-效应实验以便确定最佳的染尘浓度,根据刺激浓度的不同分为五组(Control、0、25、50、100μg/mL),采用Western blot法检测上皮-间质细胞标志物、胶原蛋白及Smad信号通路蛋白的变化.收集各组培养上清液检测羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量的变化.结果:(1)石英在体外可引起上皮细胞受损,表现为上皮形态的变化以及SP-C表达的降低;(2)石英在体外诱导RLE-6TN细胞发生EMT,表现为上皮细胞E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)表达的降低和波形蛋白(Vimentin,Vim)、纤连蛋白(Fibronectin,FN)表达的升高;(3)石英在体外诱导RLE-6TN细胞发生间质化样改变,表现为高表达的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和Hyp含量的升高;(4)石英在体外激活TGF-β/Smad信号通路并且抑制BMP-7/Smad信号通路活性.而且SP-C、E-cad、Vim、FN、Ⅰ、Ⅲ型胶原和磷酸化Smad蛋白的表达以及Hyp含量的改变都存在剂量-效应关系,同时伴有细胞形态的改变和迁移能力的增强,且在50μg/mL组的变化均具有统计学差异.第二部分TGF-β/BMP/Smad信号通路平衡对石英诱导RLE-6TN细胞间质化样改变的调节作用目的:阐明TGF-β/BMP/Smad信号通路平衡是否能够在体外对石英诱导RLE-6TN细胞发生间质化样改变发挥调节作用.方法:RLE-6TN和RAW264.7细胞冻融、传代至第三代细胞用于实验.分别使用不同浓度TGF-β抑制剂 SB-431542(5、10、20μM)或BMP抑制剂LDN-193189(1、5、10nM)预处理并经50μg/mL的石英染巨噬细胞上清液刺激RLE-6TN细胞作用48h,采用免疫荧光、Western blot法和消化法分别检测纤维化标志物、Smad信号通路蛋白及上清液中Hyp含量的变化.结果:(1)Western blot结果显示,与石英组相比,TGF-β抑制剂SB-431542预处理后,FN、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白呈现低表达且Hyp的含量降低;而加入BMP抑制剂LDN-193189预处理后,FN、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白呈现高表达且Hyp的含量升高.抑制TGF-β/Smad通路,P-Smad1/5表达增加而P-Smad2/3表达降低;相反的,抑制BMP/Smad通路,P-Smad1/5表达降低而P-Smad2/3表达升高,且以上的改变均存在剂量-效应关系;(2)免疫荧光结果显示,加入TGF-β抑制剂SB-431542(20μM)预处理后,与石英组相比,Ⅰ型胶原蛋白表达明显降低;而加入LDN-193189(10nM)预处理后,与石英组相比,Ⅱ型胶原蛋白表达明显升高.第三部分BMP-7抑制石英诱导RLE-6TN细胞间质化样改变的作用及机制目的:阐明BMP-7是否能够调控TGF-β/BMP/Smad信号通路平衡进而抑制或减缓肺泡上皮细胞的间质化程度.方法:RLE-6TN和RAW264.7细胞冻融、传代至第三代细胞用于实验.首先采用慢病毒载体感染RLE-6TN细胞,使BMP-7基因过表达或者沉默,建立稳定转染细胞株后加入50μg/mL石英染巨噬细胞上清液,培养48h后检测相关指标.第二组实验给予外源性人重组 BMP-7(Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-7,rhBMP-7),将 50μg/mL 石英染巨噬细胞上清液和 800ng/mL rhBMP-7共同进行培养48h后检测相关指标.第三组实验使用BMP-7中和抗体(10μg/mL)预处理并经50μg/mL的石英染巨噬细胞上清液刺激RLE-6TN细胞作用48h后检测相关指标.结果:(1)BMP-7沉默可以通过激活TGF-β/Smad通路以及抑制BMP/Smad通路促进石英诱导的肺泡上皮细胞间质化样改变;(2)BMP-7过表达可以通过恢复BMP/Smad通路以及抑制TGF-β/Smad通路减缓石英诱导的肺泡上皮细胞间质化样改变;(3)外源性rhBMP-7可以明显减轻石英诱导的肺泡上皮细胞间质化样改变;(4)BMP-7中和抗体可以加重石英诱导的肺泡上皮细胞间质化样改变.结论:(1)石英可在体外引起肺泡上皮细胞损伤和EMT,并引起其发生间质化样改变;(2)TGF-β/BMP/Smad信号通路平衡在石英诱导的RLE-6TN细胞间质化样改变中发挥重要作用;(3)BMP-7能够通过调节TGF-β/BMP/Smad信号通路平衡减轻石英诱导的间质化作用,BMP-7为矽肺治疗提供了新的线索.