鸭坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起以蛋鸭产蛋下降、雏鸭生长迟缓等为特征的新发传染病.2010年以来,在我国安徽、浙江、山东、江苏、福建等地区的鸭场中检测到DTMUV.该病毒已成为严重影响我国鸭群健康的新发病原体.NS1蛋白是DTMUV的非结构蛋白,主要与病毒RNA复制与致病作用有关,同时,NS1蛋白有多个抗原表位,能够诱导机体产生特异性抗体.根据DTMUV AH-F10株的全基因组序列(GenBank登录号:KM102539)设计一对引物,通过RT-PCR扩增NS1基因,构建NS1蛋白表达载体pET32a-NS1.将重组质粒pET32a-NS1转化到BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,获得分子量大小为62 kDa的重组目的蛋白.重组表达蛋白包涵体经纯化、复性、浓缩后,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,结果表明获得的重组NS1蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组NS1蛋白为包被抗原,通过优化包被浓度、封闭条件、血清稀释度、反应时间等,建立了基于NS1非结构蛋白的间接ELISA(NS1-ELISA)检测方法,其最佳检测条件是:包被蛋白浓度为40μg/mL;37℃封闭90min;血清稀释度为1:400,反应时间为37℃30min;酶标抗体工作浓度为1:2000,反应时间为37℃30min;显色时间为室温20min.应用建立的NS1-ELISA检测方法检测禽流感病毒、新城疫病毒、鸭圆环病毒、新型鸭细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清,其OD450nm均小于阴阳性血清临界值,能检出1:1600稀释的DTMUV阳性血清,批内与批间重复变异系数均小于5%.NS1-ELISA检测方法与IFA检测方法相比,阳性符合率为81%,阴性符合率100%,总符合率为93.4%.应用该方法检测采集于安徽省不同鸭场的鸭血清样本147份,阳性率为91.16%.综上所述,本研究建立的NS1-ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性.研究结果为DTMUV快速检测与流行病学调查提供一种新的血清学检测方法.
- 作者：
- 苏观志
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 兽医(专业学位)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 王桂军；于圣青
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 鸭坦布苏病毒；NS1蛋白；原核表达；间接ELISA
- Duck Tembusu virus； NS1 protein； prokaryotic expression； indirect ELISA