PEDV感染对Vero细胞周期的影响及其机制研究
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒科的α冠状病毒亚科猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种强感染致病性的传染病,该病能够引起各年龄段猪水样腹泻、呕吐和仔猪高死亡率,自2010年PED在我国大范围流行,给养猪业造成重大损失.本课题研究PEDV感染对细胞周期的影响及其相关机制,分析PEDV对Vero细胞周期的调控机制及周期阻滞对PEDV的增殖和致病性的影响,从而为揭示PEDV的分子致病机制及PED防控提供了理论支撑.本研究首先对PEDV与Vero细胞的相互作用进行研究,通过MTT法检测PEDV复制对Vero细胞活力的影响,确定本次研究PEDV感染剂量0.5 MOI,Vero细胞收集时间段为0、6、12、18、24h.用本试验室分离保存的0.5 MOI PEDV分别感染异步化和同步化的Vero细胞,胰酶消化收集感染不同时间段细胞,利用PI-BrdU双染法处理细胞,使用流式细胞术检测PEDV对Vero细胞周期的影响,结果显示PEDV引起Vero细胞周期阻滞在G0/G1期.为了进一步确定Vero细胞周期阻滞是由PEDV复制引起的,使用流式细胞术检测UV-PEDV感染的细胞,并检测PEDV的病毒滴度和sgmRNA(N、M、ORF3).结果显示UV-PEDV不能够引起细胞周期阻滞在G0/G1且TCID50和sgmRNA在PEDV感染过程中持续增加,表明Vero细胞周期在G0/G1期的积累是由PEDV的复制引起的.为了更加深入探究PEDV调控Vero细胞周期的分子机制,本课题利用Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E;细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK1(CDC2)、CDK2、CDK4、CDK6;p53信号通路p53、p-p53(Ser15)、p-p53(Ser20)、p21及内参蛋白β-actin.结果显示PEDV感染Vero细胞的24h内能够持续上调CDC2、CDK2、CDK4、Cyclin A、p53、p-p53(Ser15)、p-p53(Ser20)及p21的蛋白表达,并下调Cyclin E的蛋白表达.在接下来的试验中为证明PEDV引起细胞周期阻滞与p53信号通路调节相关,PEDV感染经过p53特异性抑制剂处理过的Vero细胞,使用流式细胞术和Western blot技术进行检测.流式细胞术检测结果显示,PEDV感染经过p53特异性抑制剂处理过的Vero细胞周期能够逆转由PEDV感染引起的G0/G1的细胞积累,并且下调了了p21、CDC2、CDK2、CDK4、Cyclin A的蛋白表达,上调了Cyclin E的蛋白表达.为了探究细胞周期阻滞与PEDV复制的生物学意义,我们通过使用常规无血清连续饥饿培养法、双胸苷孵育法和药物诺考达唑法处理Vero细胞,使其周期分别阻滞在G0/G1、G1/S和G2/M期然后感染PEDV,在感染18h后,用流式细胞仪检测细胞周期进展及qRT-PCR检测PEDV的sgmRNA(N、M、ORF3).流式细胞术检测结果显示,血清饥饿48h后80%以上的细胞同步化在G0/G1期;双胸苷孵育法处理后70%左右的细胞同步化在G1/S期;诺考达唑处理细胞16h后75%左右的细胞同步化在G2/M期,感染PEDV后都能引起细胞周期阻滞在G0/G1期.qRT-PCR和TCID50检测结果显示,同步化在G0/G1期的细胞与同步化在G1/S、G2/M和异步化的细胞相比更有利于PEDV的复制.综上所述,本研究结果表明PEDV可通过p53途径引起Vero细胞周期阻滞在G0/G1期,并进一步证实Vero细胞阻滞在G0/G1期有利于PEDV的复制,从信号分子通路上阐述了PEDV复制的分子基础,为提高PEDV繁殖及体外适应性培养提供新思路.
- 作者：
- 吴浩阳
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 预防兽医
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 孙裴
- 中图分类号：
- S858.28
- 关键词：
- 猪流行性腹泻病毒；细胞周期；p53信号通路；病毒复制
- Porcine epidemic diarrhea virus； Cell cycle； p53 signaling pathway； Viral replication