禽致病性大肠杆菌ompT缺失株特性及其对雏鸡小肠炎症相关基因表达的影响
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)导致的禽大肠杆菌病被公认为是影响世界范围内养禽业的主要细菌性疾病,给养禽业带来重大的经济损失.APEC的毒力因子有菌毛、摄铁系统、毒素和外膜蛋白等,致病性复杂,血清型多样.细菌调控基因转录表达的途径众多,PhoP/Q二元调控系统是其中一个关键途径,其中调控与外膜蛋白合成相关基因的表达是其功能之一.本实验室前期研究发现APEC phoP/Q的缺失引起ompT基因表达的显著下调.外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,OmpT)是革兰氏阴性菌中的一种外膜蛋白酶,它不仅可以作为水解蛋白的蛋白酶发挥功能,还可能是细菌的一个毒力相关因子,在病原菌的感染致病过程中起着一定作用.本试验通过Red重组技术构建了ompT缺失株及回复株,并进行生物学特性分析,基于RNA-Seq技术对ompT缺失株测序筛选并分析差异表达基因,并对ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA水平的表达进行检测,为进一步研究ompT基因在禽致病性大肠杆菌中的致病作用提供理论依据,研究内容及结果如下:1.ompT基因缺失株、回复株的构建及其生物学特性和致病性分析本试验以AE17为野生株,通过Red重组技术成功构建了ompT缺失株及回复株.细菌生长曲线测定结果显示与野生株相比,ompT基因缺失株差异不显著;环境耐受性试验表明ompT基因缺失导致菌株耐酸性显著增加(p<0.01),耐碱性显著降低(p<0.05),耐热性显著降低(p<0.01);LD50测定结果显示,ompT缺失株对雏鸡的致病力降低;组织载菌量试验结果表明,ompT缺失株显著降低感染雏鸡组织(脾脏、肝脏、肺脏)的载菌量(p<0.01);与野生株相比,ompT基因缺失后,菌株对APEC的运动能力、抗生素的敏感性及抗吞噬能力差异不显著.2.基于RNA-Seq筛选APEC ompT缺失株差异表达基因为了探索ompT缺失对APEC基因水平的影响,本试验通过RNA-Seq技术从转录组水平筛选ompT缺失引起的差异表达基因,结果显示有490个差异表达基因,其中包括125个下调表达基因,365个上调表达基因.GO功能结果表明差异基因主要涉及铁离子稳态、裂解酶活性、肽聚糖生物合成过程、细胞形态调控等生物学过程;KEGG通路分析结果显示差异基因主要涉及细菌趋化性、生物膜形成、鞭毛装配、脂多糖生物合成等通路.筛选出fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU等与毒力相关的基因.通过RT-PCR验证了部分差异基因(fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、cheA、irp2)的表达,结果与RNA-Seq中基因表达变化趋势一致,说明RNA-Seq结果可靠.3.RT-PCR检测ompT缺失株感染雏鸡小肠炎症相关基因mRNA的转录水平通过RT-PCR比较攻毒组与对照组雏鸡空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA水平的转录水平.结果显示攻毒12h、24h和48h后缺失株攻毒组的PTGDS基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低(p<0.01或p<0.05),攻毒12h、24h后PTGDS基因mRNA的表达量高于0h、48h和72h.攻毒12h后,所有攻毒组的MME基因mRNA的表达量较0h显著降低;攻毒24h、48h后缺失株攻毒组的MME基因mRNA的表达量较AE17攻毒组显著降低(p<0.01或p<0.05).综上所述,本试验成功构建了ompT缺失株及回复株,缺失ompT后导致耐酸性增强,耐碱性、耐热性降低,肝脏、脾脏、肺脏载菌量减少,显著降低了APEC的毒力和致病性,但对运动性、药物敏感性、抗吞噬能力方面影响不显著.APEC ompT基因的缺失引起毒力相关基因(fliY、ompF、ibeT、aphA、motB、rfaQ、flgK、cheA、irp2、asnC、ycgR、lpxK、kpsU)的表达变化.APEC感染雏鸡引起空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA的表达变化,且菌株缺失ompT后影响空肠炎症相关基因PTGDS、MME mRNA的表达,说明炎症相关基因PTGDS、MME参与了机体抗APEC感染的过程,且ompT可能参与APEC感染机体的过程.
- 作者：
- 王琦
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 基础兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 祁克宗
- 中图分类号：
- S858.31
- 关键词：
- 禽致病性大肠杆菌；ompT；基因缺失；生物学特性；雏鸡小肠；炎症相关基因
- Avian pathogenic E.coli； ompT； gene deletion； biological characteristics； small intestines of chicks； inflammation related genes