山羊卵泡期与黄体期"下丘脑-垂体-卵巢"miRNA分析及靶基因验证
本试验主要采用高通量测序,探究miRNA在山羊发情周期中差异表达变化,并预测其靶基因,通过GO和KEGG富集分析找出与山羊发情调控的相关通路.本研究将从表观遗传上,探究山羊发情周期中miRNA差异表达的变化,有利于阐述山羊发情规律分子机制,将为下一步的分子育种以及选育具有高繁殖力的种群奠定理论基础.(1)将采集到的安淮山羊卵泡期与黄体期的下丘脑、垂体、卵巢组织进行高通量测序.此次测序所建立的6个文库中,卵泡期下丘脑(FH)、黄体期下丘脑(LH)、卵泡期垂体(FP)、黄体期垂体(LP)、卵泡期卵巢(FO)、黄体期卵巢(LO)中分别得到12125000、11696869、11319069、11432846、11727490、12209928个原始序列,过滤掉低质量的序列得到11788536、11344763、11162888、11016438、11546193、12013471条纯净序列.(2)为得到6个文库中miRNA表达谱及其在山羊基因组中的具体信息,我们将对6个文库中的miRNA进行靶基因预测,并进行相关生物信息学分析.与NCBI上山羊基因组进行同源类比,FH、LH、FP、LP、FO、LO 6文库中分别鉴定390、384、368、371、342、352种已知miRNA,其中302种在这6个文库共表达;以及159、201、75、125、70、94种新miRNA,其中20种新miRNA共表达于这6个文库中.(3)通过GO与KEGG富集分析出对6文库中的差异表达miRNA靶基因所参与的细胞组成、分子功能以及生物学过程.(4)从6文库中随机选取若干miRNA以U6为内参基因采用qPCR验证测序结果,结果发现定量结果与miRNA测序结果的趋势基本一致.(5)从FO与LO中差异表达miRNA中挑选chi-miR-144-3p,并对其进行生物信息学分析到其靶基因为Follistain,利用双荧光素酶报告试验验证其靶向关系,成功构建Follistain的过表达与干扰的病毒载体,以备下一步的功能验证.总之,本研究采用高通量测序技术对山羊发情周期中下丘脑、垂体、卵巢组织进行测序分析.结果不仅发现多种新miRNA,且经过靶基因的预测分析,预测多种可能参与到山羊的发情的关键通路,且通过双荧光素酶试验检测出其中miR-144-3p的一个靶基因为Follistain.
- 作者：
- 吴昊
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 动物遗传育种与繁殖
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 凌英会
- 中图分类号：
- S827
- 关键词：
- 山羊；下丘脑-垂体-卵巢；miRNA；发情周期；高通量测序
- Capra hircus； miRNA； estrous cyclicity； high throughput sequencing