水稻及拟南芥砷酸盐还原酶基因的功能研究
Functional Analysis of Arsenate Reductases in Rice and Arabidopsis

砷(As)是对植物与人类有害的一种类金属元素,土壤砷污染主要以无机砷污染为主.植物对无机砷的吸收主要分为对五价砷[As(V)]与三价砷[As(Ⅲ)]的吸收.在好氧环境中,土壤中的无机砷主要以As(V)通过磷转运蛋白进入植物体内.在淹水条件下,水稻根系分泌的氧气可能氧化土壤根际的As(Ⅲ),因此也会有部分As(V)通过磷转运蛋白被植物吸收.被植物吸收到体内的As(V)能够迅速被还原成As(Ⅲ),As(Ⅲ)能够通过与植物螯合素(PCs)络合形成螯合物并被转运到液泡贮存进行解毒,这一解毒方式显著降低砷向地上部的运输;被还原的As(Ⅲ)也能够通过外排系统排出植物体外.在As(V)解毒过程中,植物体内As(V)向As(Ⅲ)的还原过程是影响解毒效率的重要因素.近年来,人们对多种植物体内的砷酸盐还原酶基因进行了克隆与研究,特别对模式植物拟南芥的研究较为深入.近期研究报道显示拟南芥AtHACl(High Arsenic Content 1)参与植物体内As(Ⅴ)向As(Ⅲ)的还原过程,沉默AtHAC1会显著降低拟南芥对As(V)的还原能力并降低植株对As(V)的耐性,导致砷在植物地上部大量积累.而对于水稻这一重要的粮食与模式作物,我们对其体内砷酸盐还原酶基因的功能特性了解甚少.本课题首先以拟南齐砷酸还原酶基因At也HAC1为研究对象,通过原核表达分析表明AtHAC1能够回补大肠杆菌砷酸盐还原酶突变体AarcC对As(V)的还原能力,提高突变体对As(Ⅴ)的耐性.对获得的AtHAClT-DNA插入沉默突变体进行一系列生理试验.在0-200 μM不同浓度梯度As(V)处理条件下,我们对突变体材料以及野生型植株对砷的吸收与积累进行分析研究.结果表明:AtHAC1沉默表达能显著提高拟南芥根系与地上部对砷的积累,并且发现突变AtHAC1显著降低拟南芥对As(V)的耐性.获得主要研究结果表明AtHAC1能够参与拟南芥体内As(V)的还原过程.通过与AtHAC1进行同源分析比对,我们从水稻中克隆出砷酸盐还原酶基因OsHAC1;1与OsHAC1,.2,并以其作为研究对象,利用异源表达系统分析OsHAC1;1与OsHAC1;2的体外功能;利用qRT-PCR,GUS组织定位,原生质体亚细胞定位等技术分析OsHA与QsHAC1,2的时空表达模式;利用超表达及CRISPR/Cas9定点突变技术获得OsHAC1;1与OsHAC1;2超表达和OsHAC1;1转基因材料,并获得OsHAC1;2的T-DNA插入突变体;通过qRT-PCR、PCR测序方法分析转基因材料超表达及沉默效果;利用水培与盆栽等一系列生理实验研究了OsHAC1;与OsHAC1;2的生物学功能,所获得的主要研究结果如下:1.通过生物信息学分析表明水稻砷酸盐还原酶OsHAC1;1与OsHAC1;2与拟南芥AtHAC1同源性高达80%以上.通过原核表达分析表明OsHAC1;1与OsHAC1;2能够回补大肠杆菌砷酸盐还原酶突变体△arcC对As(V)的还原能力,提高突变体对As(V)的耐性.qRT-PCR结果显示OsHAC1;1与OsHAC1;2在水稻根系的表达量高于地上部,且当受到As(V)胁迫时,两基因的表达量受到诱导显著提高;而当受到As(III)胁迫时,两基因的表达量降低.对两基因的GUS转基因材料进行分析显示OsHAC1;1与OsHAC1;2在水稻根系与地上部均有强烈表达,且在根系表皮细胞以及中柱表达强烈.水稻原生质体亚细胞定位实验表明OsHAC1;1与OsHAC1;2主要在细胞核与细胞质表达.2.通过水稻转基因分别得到了OsHAC1;1、OsHAC1;2的超表达转基因水稻材料和OsHAC1;1的CRISPR/Cas9点突变转基因水稻材料,通过购买获得OsHAC1;2的T-DNA插入突变体材料.通过qRT-PCR鉴定获得目的基因超表达的阳性株系,并且通过PCR测序以及qRT-PCR鉴定获得目的基因沉默表达的突变体株系.3.在2-20 μM不同浓度梯度As(V)处理条件下,我们对突变体材料,超表达材料以及野生型植株对砷的吸收与积累进行分析研究.结果表明:OsHAC1;1与OsHAC1;2沉默表达能显著提高水稻根系与地上部对砷的积累,而OsHAC1;1与OsHAC1;2的超表达材料对砷的积累量较野生型植株显著降低.4.对OsHAC1;1与OsHAC1;2的突变体材料,超表达材料以及野生型植株进行水培试验,研究OsHAC1;1与OsHAC1;2沉默或者超表达是否影响水稻对As(V)的还原能力以及对砷的积累.结果表明:OsHAC1;1与OsHAC1;2沉默突变体中As(Ⅲ)/As(V)含量比值较野生型显著降低,突变体材料外排As(Ⅲ)的效率较野生型显著降低,表明沉默OsHAC1;1与OsHAC1;2的表达能降低水稻对As(V)的还原能力.OsHAC1;1与OsHAC1;2基因超表达材料中As(Ⅲ)/As(V)含量比值较野生型显著提高,且根系As(Ⅲ)外排效率较野生型显著提高,表明OsHAC1;1与OsHAC1;2超表达能显著提高水稻对As(V)的还原能力,促进As(Ⅲ)外排,降低砷向地上部的转运与积累.5.设计水培As(Ⅴ)浓度梯度试验,研究超表达材料与野生型植株受As(Ⅴ)的毒害以及对As(V)的耐性.结果表明超表达OsHAC1;1与OsHAC1;2能够显著提高水稻对As(V)的耐性,增强水稻根系在高浓度As(V)胁迫环境下的生长能力.6.设计旱作以及干湿交替两种栽培方式的盆栽试验,对OsHAC1;与OsHAC1;2的突变体材料及其野生型植株、超表达材料以及其野生型植株在全生育期的表型以及籽粒砷含量进行研究.结果表明在旱作条件下,OsHAC1;1与OsHAC1;12基因沉默与超表达均不影响植株的生长,而OsHAC1;1突变体籽粒中总砷含量较野生型显著提高36%左右,OsHAC1;2沉默突变体籽粒中总砷含量较野生型提高20%左右.OsHAC1;1与OsHAC1;2的超表达材料中水稻籽粒中总砷含量较野生型分别显著降低19%-20%与15%-20%.在干湿交替的栽培条件下,沉默或者超表达OsHAC1;1与OsHAC1;2不影响水稻的生长,对籽粒中总砷含量也没有显著改变.为充分了解水稻体内参与砷酸盐还原过程的基因功能,我们对前人报导的另一类砷酸盐还原基因OsACR2;1与OsACR2;2进行了部分功能研究.结果发现OsACR2;1与OsACR2;2在异源表达体系中能够回补大肠杆菌突变体△arsC对As(Ⅴ)的还原能力,但是沉默表达OsACR2;1与OsACR2;2并不显著改变水稻对As(Ⅴ)的还原能力、As(Ⅲ)外排及植株砷的积累,表明在水稻体内OsACR2;1与OsACR2;2并不参与As(Ⅴ)向As(Ⅲ)的还原过程.综上所述,水稻砷酸盐还原酶OsHAC1;1与OsHAC1;2参与水稻体内As(V)向As(Ⅲ)的还原过程.超表达OsHAC1;1与OsHAC1;2能够显著提高水稻对As(V)的还原能力,降低砷向植株地上部的运输,降低水稻籽粒对砷的富集.