桂籽活性成分提取及其对小鼠免疫性肝损伤的保护作用
目的:以桂籽为原材料,从中提取分离出环烯醚萜苷,进行含量测定,探讨对其对肝脏的保护作用.方法:1.桂籽采用95%乙醇回流提取,石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取,D101大孔树脂进一步纯化;以特女贞苷、女贞苷G13为对照品,采用紫外全波长扫描(UV)确定检测波长,高效液相色谱法(HPLC)进行方法学验证,再对桂籽中的环烯醚萜苷进行含量测定.2.成年昆明雄性小鼠60只,随机分为6组,每组10只,依次为空白组、模型组、阳性对照组、桂籽环烯醚萜苷提取物低剂量组、桂籽环烯醚萜苷提取物中剂量组、桂籽环烯醚萜苷提取物高剂量组.空白组和模型组给以双蒸水10 mg/kg(0.1mL/10g)灌胃,阳性对照组以醋酸泼尼松灌胃给药,剂量为6.4 mg/kg,桂籽环烯醚萜苷提取物低、中、高剂量组给予桂籽环烯醚萜苷提取物灌胃给药,剂量分别为125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg,每天1次,连续给药10 d.末次给药1 h后,空白组给予生理盐水尾静脉注射,剂量为10 mg/kg(10 mL/kg),其余各组均尾静脉注射刀豆蛋白A建立免疫肝损伤模型,剂量为20 mg/kg,禁食,自由饮水.造模完成12 h后,摘眼球取血,离心后留取血浆,检测ALT、AST、以及ELISA方法测定血浆中的IFN-γ、TNF-α,后颈椎脱臼处死小鼠摘取肝脏和脾脏,4℃生理盐水中清洗,滤纸拭干后称记重量,计算肝脾指数.肝组织一部分制成10%肝组织匀浆,离心后取上清液检测MDA、SOD的水平,一部分进行固定、脱水、石蜡包埋、切片后行常规HE染色,光学显微镜下观察肝组织形态学变化,一部分用WB检测各组小鼠肝组织中p38MAPK以及p-p38MAPK的表达水平.结果:1.桂籽采用95%乙醇回流提取,石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取提取分离得到环烯醚萜苷粗品,以特女贞苷、女贞苷G13为对照品,采用紫外全波长扫描(UV)确定检测波长、高效液相色谱法(HPLC)进行方法学验证,再对桂籽中的环烯醚萜苷进行含量测定,结果表明,特女贞苷、女贞苷G13在24.72μg/mL-494.41μg/mL、24.50μg/mL-490.00μg/mL线性关系良好,回归方程分别为Y1=4.6045 X-21.392,R2=0.9996;Y2=3.9901X-10.508,R2=0.9992.桂籽正丁醇萃取部位中特女贞苷和女贞苷G13的百分含量分别为39.20%、39.88%,经大孔树脂纯化后,特女贞苷、女贞苷G13进一步富集,含量分别为82.56%、87.94%.2.与空白组比较,模型组小鼠肝脾指数、血浆中ALT、AST、IFN-γ、TNF-α以及肝组织匀浆上清液中MDA含量均显著升高(P<0.01),肝组织匀浆上清液中SOD含量明显降低(P<0.01),肝组织中p-p38MAPK的表达明显增强(P<0.01),模型组小鼠病理切片结果显示广泛肝细胞肿胀,胞质疏松至空泡化,胞浆淡染,双核、多倍体核可见,肝板消失,成功建立刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝损伤模型.3.与模型组比较,阳性对照组、桂籽环烯醚萜苷提取物中、高剂量组可显著降低小鼠肝脾指数以及血浆ALT、AST水平,降低肝组织匀浆上清液中的MDA,而升高SOD的含量,差异有统计学意义.此外,相较于模型组,阳性对照组、桂籽环烯醚萜苷提取物低、中、高剂量组肝组织病理切片结果显示其病理变化有不同程度的减轻,能不同程度的降低小鼠血浆中IFN-γ、TNF-α的水平,其中阳性对照组能显著性降低小鼠血浆中的IFN-γ、TNF-α的水平,桂籽环烯醚萜苷低、中、高剂量组对小鼠血浆中IFN-γ的影响差异有统计学意义,桂籽环烯醚萜苷中、高剂量组对小鼠血浆中TNF-α的影响差异有统计学意义,阳性对照组、桂籽环烯醚萜苷高剂量组对小鼠肝组织中的p-p38MAPK表达的影响差异有统计学意义.结论:1、采用95%乙醇回流提取,石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取的提取方法简单方便,提取率较高;以特女贞苷、女贞苷G13为对照品,采用紫外全波长扫描(UV)、高效液相色谱法(HPLC)对桂籽环烯醚萜苷进行含量测定方法稳定性良好,重现性好,可用于桂籽环烯醚萜苷的含量测定.2、桂籽环烯醚萜苷提取物对刀豆蛋白A所致免疫性肝损伤小鼠的肝脏有较好的保护作用,其机制可能与抑制p38MAPK的磷酸化、抑制炎性介质的释放、提高肝细胞抗氧化能力、减弱脂质过氧化反应的发生有关.
- 作者：
- 刘东阳
- 学位授予单位：
- 湖北科技学院
- 专业名称：
- 药学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2018年
- 导师姓名：
- 闵清；夏松柏
- 中图分类号：
- R285.5
- 关键词：
- 桂籽；环烯醚萜苷；含量测定；HPLC；肝损伤
- Osmanthus fragrans； Iridoid glycosides； Content determination； HPLC； liver injury